磁性殼聚糖微球的制備及其固定化乳糖酶的研究

許可，曾丹林，吳潔，王園園，楊媛媛，王光輝

(武漢科技大學 化學與化工學院 湖北省煤轉化與新型炭材料重點實驗室，湖北 武漢 430081)

殼聚糖(CS)，是唯一大量存在于自然界中的陽離子堿性多糖[1]，其分子鏈上含有大量的氨基和羥基，具有高反應活性，在化工、生物、材料、食品和環保等[2-5]領域具有廣泛的應用價值。

乳糖酶，被廣泛應用于乳制品的加工和治療乳糖不耐癥[6-7]。近年來，將兼具高分子材料和磁性物質雙重特性的磁性殼聚糖用于固定化乳糖酶成為了學者們的研究熱點，以其為載體制備的固定化酶活力高、半衰期長、性能穩定[8]。

本文以磁性殼聚糖微球為載體，制備了固定化乳糖酶，以酶活力為考察指標，研究了不同固定化條件對制備固定化酶的影響，以及固定化酶的酶學性質，為其工業應用提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖、乳糖酶(來源于米曲霉)、鄰硝基苯酚(ONP)、鄰硝基苯酚-β-半乳糖苷(ONPG)、甲醛、Span 80、冰醋酸、乙醇、FeCl3·6H2O、檸檬酸三鈉、尿素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺均為分析純。

100 mL水熱反應釜，由上海予名儀器設備有限公司提供；UV1800-PC 型紫外可見光分光光度計；Vertex70 型傅里葉紅外光譜儀；Nova 400 Nano型掃描電子顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 Fe3O4納米粒子的制備 分別稱取8 mmol檸檬酸三鈉、4 mmol FeCl3·6H2O和12 mmol尿素置于燒杯中，加入80 mL蒸餾水攪拌均勻至完全溶解，再加入0.6 g聚丙烯酰胺，攪拌溶解，再加入0.3 g聚乙二醇，溶解后將溶液轉入反應釜中，200 ℃真空干燥箱中反應12 h，冷卻至室溫后，用磁鐵分離，再經蒸餾水、無水乙醇反復洗滌，真空干燥得到磁性Fe3O4納米粒子。

1.2.2 磁性殼聚糖微球的制備 量取20 mL 3%的醋酸殼聚糖溶液于圓底燒瓶中，加入一定量的Fe3O4磁性納米粒子，超聲分散30 min，將混合溶液加入到有160 mL液體石蠟溶液(3 mL Span 80)中，充分攪拌混合均勻，加入6 mL甲醛，40 ℃條件下反應1 h，然后用1 mol/L的NaOH溶液將pH調至9～10，升溫至70 ℃，繼續反應2 h，用磁鐵收集沉淀物，用蒸餾水和無水乙醇反復洗滌，在真空干燥箱中60 ℃條件下干燥，得到磁性殼聚糖微球。

1.2.3 磁性殼聚糖微球固定化乳糖酶

1.2.3.1 固定化方法 將一定量的磁性殼聚糖微球(M-CS)加入到磷酸緩沖液中溶脹2 h，用磁鐵收集溶脹后的磁性殼聚糖微球，再加入到一定濃度的乳糖酶磷酸緩沖液中，置于恒溫振蕩器上室溫振蕩1 h，于4 ℃條件下冰箱中靜置，然后用磁鐵將其沉淀在底部，傾倒出上層清液，得到磁性殼聚糖微球固定化乳糖酶，用磷酸緩沖液充分洗滌，最后于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3.2 鄰硝基苯酚(ONP)標準曲線的繪制 取一定量的鄰硝基苯酚(ONP)于燒杯中，加入10 mL乙醇溶液使之完全溶解，用蒸餾水定容至1 000 mL，并混合均勻，分別吸取配制的溶液2，4，6，8，10，12，14 mL于100 mL容量瓶中，用NaHCO3溶液定容，稀釋后的溶液濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 μmol/mL，測定420 nm處吸光度，然后以鄰硝基苯酚(ONP)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線見圖1。

圖1 ONP標準曲線Fig.1 Standard curve of ONP

1.2.3.3 乳糖酶酶活測定方法 采用ONPG法測定乳糖酶酶活。

乳糖酶活力定義：以ONPG為底物，在一定條件下，每分鐘催化ONPG生成1 μmol鄰硝基苯酚(ONP)所需的乳糖酶酶量定義為一個酶活力單位(u)。

底物鄰硝基苯酚-β-半乳糖苷(ONPG)在乳糖酶的作用下，可水解為鄰硝基苯酚(ONP)，鄰硝基苯酚在堿性條件下呈黃色，且在波長420 nm處有吸收，因此結合ONP標準曲線可對其進行定量分析，從而測定乳糖酶的活力。

1.2.3.4 固定化酶酶活的測定 向一定量的固定化酶中加入磷酸緩沖液，40 ℃下保溫5 min，加入3 mL 4 g/L的ONPG溶液，反應10 min后，加入2 mL Na2CO3溶液滅活，于分光光度計上測定波長420 nm處的OD值。

式中U2——加入的游離酶總活力；

k——ONP標準曲線的斜率，為5.9；

T——反應時間，為5 min。

2 結果與討論

2.1 結構表征

2.1.1 SEM分析 圖2為磁性殼聚糖微球的SEM圖。

由圖2可知，制得的磁性殼聚糖微球粒徑在30～60 μm，微球形貌規整，球形較好，表面光滑，分布較為均勻無粘連。

圖2 磁性殼聚糖微球的SEM圖Fig.2 SEM of magnetic chitosan microspheres

2.1.2 FTIR分析 圖3為殼聚糖(CS)、磁性殼聚糖微球(M-CS)和Fe3O4納米粒子的紅外光譜圖。

圖3 CS、M-CS和Fe3O4的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of CS，M-CS and Fe3O4

由圖3可知，3 400 cm-1附近處吸收峰是由 —NH2和 —OH鍵的伸縮振動引起的，說明殼聚糖和磁性殼聚糖微球表面均含有大量的氨基和羥基。2 925 cm-1和2 860 cm-1處的吸收峰是由脂肪族C—H的伸縮振動引起的，1 060 cm-1處是由C—O—C伸縮振動引起的。對比殼聚糖和磁性殼聚糖微球可以看出，1 650 cm-1處出現新的特征峰，是由新出現的Shiff堿鍵(C≡N)特征峰引起的，這證明了交聯劑的 —CHO與殼聚糖上的 —NH2發生了交聯反應。此外，在磁性殼聚糖微球和Fe3O4譜線的570 cm-1處出現了Fe—O鍵的特征吸收峰，表明磁性殼聚糖中含有Fe3O4。

2.1.3 磁響應性分析(VSM) 圖4是Fe3O4和磁性殼聚糖微球的磁滯回線。

由圖4可知，兩者均具有超順磁性，Fe3O4和磁性殼聚糖微球的飽和磁化強度M分別達到37.83 emu/g和11.14 emu/g。當Fe3O4與殼聚糖形成復合物之后，飽和磁化強度M會有所降低，一方面是由于形成的磁性殼聚糖微球中磁性物質占比較小，另一方面也是由于制備磁性殼聚糖微球過程中Fe3O4會被氧化導致飽和磁化強度降低，仍具有較強的磁響應性。

圖4 Fe3O4和磁性殼聚糖微球的磁滯回線Fig.4 Magnetic hysteresis of Fe3O4 and M-CS

2.1.4 XRD分析 圖5是Fe3O4和磁性殼聚糖微球的XRD圖譜。

圖5 Fe3O4和磁性殼聚糖微球的XRD圖譜Fig.5 XRD spectra of Fe3O4 and M-CS

由圖5可知，各衍射峰與粉末衍射標準聯合會(JCPDS)編制的標準粉末衍射PDF卡片19-0629的峰位置基本一致，各衍射峰分別為Fe3O4(220)、(311)、(400)、(422)、(511)和(440)的晶面衍射峰。表明磁性殼聚糖中含有Fe3O4，這與FTIR表征結果一致。磁性殼聚糖微球的譜線在2θ=10～28°出現了一個較寬的衍射峰，對應無定形碳碳面的衍射峰。

2.2 乳糖酶固定化條件的優選

2.2.1 pH對酶活性的影響 考察磷酸緩沖液pH分別為6.4，6.6，6.8，7.0，7.2對固定化乳糖酶酶活性的影響，測得的固定化乳糖酶相對活力見圖6。

圖6 pH值對酶活性的影響Fig.6 Effect of the pH on enzyme activity

由圖6可知，隨著pH值的增加，固定化酶的酶活性呈現先增后減的趨勢，當磷酸緩沖液的pH為7.0時，固定化得到的酶活性最高。乳糖酶通過靜電吸附固定在磁性殼聚糖微球表面，溶液酸堿度的變化會影響微球表面活性基團的電性，同時也會影響乳糖酶所帶的電荷，從而影響乳糖酶在磁性殼聚糖微球表面的吸附[9]，因此，在中性條件下，制備得到的固定化酶活性最高。

2.2.2 固定化時間對酶活性的影響 考察磁性殼聚糖微球對乳糖酶的吸附時間對酶活性的影響，分別于4 ℃條件下靜置1，2，4，6，8 h進行固定化，測試固定化酶的酶活性，并計算相對酶活，結果見圖7。

圖7 固定化時間對酶活性的影響Fig.7 Effect of the immobilization time on enzyme activity

由圖7可知，隨著固定化時間的增加，酶活性逐漸增加，當固定化時間達到4 h時，酶活性的變化較小，趨于穩定，表明磁性殼聚糖微球對于乳糖酶的吸附趨于飽和，因此，選用的固定化時間為4 h。

2.2.3 加酶量對酶活性的影響 由于磁性殼聚糖微球對酶的固定量是一定的，在保證不造成酶的浪費的前提下盡可能的使磁性殼聚糖微球固定更多的酶，考察了酶液濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mg/mL時固定化酶酶活性以及酶活回收率，測定結果見圖8。

由圖8可知，隨著乳糖酶濃度的增加，固定化酶的活力逐漸增加，而酶活回收率逐漸減小，當酶液濃度達到0.6 mg/mL時，若繼續增加酶液濃度，固定化酶酶活性增加的幅度較小，而酶活回收率呈現急劇下降的趨勢。這是由于磁性殼聚糖微球上可與乳糖酶結合的位點的數量是固定的，在結合位點飽和之前，固定化酶的活性會隨著給酶量的增加而增加，當位點趨于飽和時，給酶量的增加對于固定化酶酶活性的提升影響較小，而且會使酶活回收率明顯降低。因此，綜合考慮酶制劑的成本、固定化酶活性以及酶活回收率，選擇酶液濃度為0.6 mg/mL。

圖8 加酶量對酶活性的影響Fig.8 Effect of enzyme addition on enzyme activity

2.3 固定化酶的酶學性質

2.3.1 固定化酶pH穩定性 25 ℃條件下，分別將游離乳糖酶和固定化乳糖酶置于不同pH(6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5)的磷酸緩沖液中，10 min后，測定固定化酶和游離酶的酶活性，計算相對酶活，結果見圖9。

圖9 固定化乳糖酶的pH穩定性Fig.9 pH stability of immobilized lactase

由圖9可知，固定化酶和游離酶的活性都隨著pH的增加呈現先上升后下降的趨勢，游離酶在pH為7.0時活性最高，固定化酶在pH為8.0時活性最高。與游離酶相比，固定化酶的pH穩定性明顯高于游離酶，特別是對堿的耐受性增加明顯。這是由于在固定化過程中，酶與載體的多位點結合使固定化酶的構象更加穩定，降低了外部溶液對固定化酶分子結構的影響。此外，殼聚糖上含有大量的氨基和羥基，使其在堿性溶液中具有一定的緩沖作用，減弱外部溶液對酶蛋白和活性基團的破壞作用。在最適pH范圍內，固定化酶相對于游離酶具有更寬的pH適用范圍，表明固定化酶具有較好的pH穩定性。

2.3.2 固定化酶的溫度穩定性 將固定化酶和游離酶在pH為7.0條件下，置于不同的溫度條件下預熱10 min，測定固定化酶和游離酶的酶活性，結果見圖10。

圖10 固定化乳糖酶的熱穩定性Fig.10 Thermal stability of immobilized lactase

由圖10可知，隨著溫度的升高，固定化酶和游離酶的活性均呈現降低的趨勢，40 ℃下預熱10 min后，固定化酶酶活性仍保持78.5%，而游離酶僅存47.4%，說明固定化后的乳糖酶熱穩定性提高，可以適應相對較高的溫度。固定化酶熱穩定性提高是因為固定化后酶與載體之間相互作用，使得酶分子結構剛性增強，使得其抗拒熱變性作用的能力提高，因此，固定化乳糖酶具有更好的熱穩定性。

2.3.3 固定化酶的重復利用率 在25 ℃、pH為8.0的條件下，將固定化乳糖酶重復使用5次，測定每次使用后固定化乳糖酶的酶活性，結果見圖11。

圖11 固定化乳糖酶的熱穩定性Fig.11 Thermal stability of immobilized lactase

由圖11可知，隨著使用次數的增加，固定化酶的酶活性逐漸降低，重復使用5次后，酶活性仍保留有65%以上。由于使用過程中磁分離都會有磁性粒子損失，使得酶活性降低，除去這一部分損失，可見固定化酶擁有良好的操作穩定性。

3 結論

以殼聚糖、FeCl3·6H2O為原料，采用乳化交聯法制備了磁性殼聚糖微球。制備得到的磁性殼聚糖微球形貌規整，表面光滑，微球之間分散性較好，無黏連，表面存在著大量的 —NH2、—OH等官能團，且具有良好的磁響應性。以酶活力為考察指標，研究了不同固定化條件對制備固定化酶的影響，以及固定化酶的酶學性質。

(1)乳糖酶的最佳固定化條件為：固定化時間4 h，pH為7.0，乳糖酶酶液濃度為0.6 mg/mL，制得的固定化乳糖酶的酶活為58%，酶活回收率為35%。

(2)相較于游離酶，固定化乳糖酶的熱穩定性和pH穩定性均有所提高，尤其是耐堿性，同時，固定化酶也擁有良好的操作穩定性，重復使用5次后，酶活性仍保留65%以上。