本草香對主流煙氣暴露大鼠心血管系統蛋白組學的影響研究

劉夢雅，蘇加坤，王若琪，徐 達，秦秀軍，李建國，安 全，蔡繼寶，*

(1.中國輻射防護研究院，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室，中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點實驗室，山西 太原030006；2.江西中煙工業有限責任公司，江西 南昌 330096)

據2019年發布的《中國心血管病報告2018》顯示，我國心血管病現患人數為2.9億，心血管病死亡率居首位[1]。流行病學數據分析以及許多試驗研究結果表明，吸煙除直接危害到人體的呼吸系統外，對人體的心腦血管、消化道等組織器官均產生不同程度的損害[2]。而多項研究表明煙草中含有引起冠狀動脈硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病的發病率升高的成分[3-5]。本草香是香藥本草制備的各種香料，其在疾病預防與治療方面的功用也受到人們的關注[6]，本研究采用添加本草香成分香煙與普通香煙干預大鼠后，利用串聯質譜標記(tandem mass tags，TMT)定量蛋白質組學研究技術探索本草香對大鼠心血管系統相關蛋白的改變情況，旨在尋找差異蛋白以及相關生物學通路，為進一步研究本草香的生物學功效提供研究線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠24只，體質量200～220 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號SCXK-(京)2016-0006，質量合格證號11400700300671。飼養管理于中國輻射防護研究院動物實驗中心，實驗動物使用許可證號SYXK(晉)2013-0002。

1.2 試劑和主要儀器

普通卷煙和添加本草香成分的金圣4號卷煙，均產自江西中煙工業有限責任公司，每支卷煙含煙堿1.0 mg，焦油10.0 mg，一氧化碳10.0 mg；HRH-WBE 3986型動物全身煙氣暴露系統，購于北京慧榮和科技有限公司；TMT標記試劑盒，購于Thermo Fisher公司。

1.3 動物分組及處理

根據動物體質量按分段均衡隨機分組法(DAS1.0軟件)將動物進行分組，分為普通香煙煙氣暴露組和金圣4號香煙煙氣暴露組，每組12只。兩組分別放置于染毒腔體內進行主流煙氣暴露染毒60 min，煙氣濃度控制在(1 100±110)mg/m3。每天染毒1次，3個月后麻醉取心臟，送樣本檢測。

1.4 蛋白提取及TNT定量蛋白質組學實驗操作步驟

將冷凍的樣品心臟組織取出適量，轉移至1.5 mL離心管中。加入300 μL樣品裂解液，加入蛋白酶抑制劑PMSF使其終濃度為1 mmol/L。冰上超聲破碎3 min。將溶液在室溫下12 000 r/min離心10 min，取上清，并再次離心取上清。上清即為樣品的總蛋白溶液，進行蛋白濃度測定并分裝后儲存于-80℃備用。蛋白采用BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取10 μg蛋白，采用12%SDS-PAGE進行分離；分離后的凝膠采用考馬斯亮蘭染色法進行染色。胰蛋白酶酶解及標記：蛋白定量后每個樣品各取100 μg于10 K的超濾管中，取120 μL還原劑緩沖液(10 mmol/L DTT，8 mol/L尿素，100 mmol/L TEAB，pH=8.0)，60℃反應1 h；加入IAA至終濃度為50 mmol/L，室溫避光反應40 min；4℃、12 000 r/min離心20 min，棄掉收集管底部溶液；加入300 mmol/L的TEAB緩沖液100 μL，12 000 r/min離心20 min，2次；更換新收集管，在超濾管中加入300 mmol/L的TEAB緩沖液100 μL，并加入1 μg/μL的測序級胰蛋白酶溶液2 μL，37℃反應12 h；12 000 r/min離心20 min，收集酶解后肽段，在超濾管中再加入200 mmol/L的TEAB緩沖液50 μL，12 000 r/min離心20 min，收集管底溶液并凍干。向凍干樣品中加入200 mmol/L的TEAB緩沖液100 μL，渦流混勻，取出40 μL樣品于1.5 mL EP管中進行標記反應；從冰箱中取出TMT試劑，平衡到室溫，加入41 μL無水乙腈，渦流5 min，離心；取41 μL TMT試劑加到樣品中，渦流混勻，室溫放置1 h；加入8 μL 5%羥胺終止反應15 min，凍干后于-80℃保存。反相色譜分離：梯度洗脫收集8～60 min的樣品，依次每隔1 min收集洗脫液到1～15號離心管中，按此順序循環收樣至梯度結束。收集好后真空冷凍干燥抽干，樣品冷凍保存進行質譜檢測。

1.5 數據處理與分析

采用Proteome DiscovererTM2.2(美國Thermo公司)軟件分析差異蛋白，所用數據庫為來自于UniProt的大鼠數據庫。肽段鑒定的假陽性率控制在1%以下，利用倍數變化值進行差異蛋白篩選，篩選的標準為上調或者下調倍數變化值≥1.2且P≤0.05。采用基因本體(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Gene and Genomic Encyclopedia，KEGG)數據庫對差異蛋白進行富集分析，以判定差異蛋白主要影響的生物學功能或者通路。對差異蛋白進行非監督層次聚類，利用熱圖的形式展示差異基因在不同樣本間的表達模式。

2 結果

2.1 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異表達蛋白

用TMT法檢測吸煙3個月后普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織蛋白的表達情況，在兩組組織中，表達水平差異在1.2倍以上的蛋白43個，其中在金圣4號香煙組心臟組織中下調表達41個，上調表達2個。圖1將比較產生的差異表達情況反映到火山圖中，圖2為聚類分析結果，即對差異表達蛋白進行的非監督層次聚類，如同一樣品能通過聚類出現在同一簇中，則聚在同一簇中的蛋白可能具有相似的生物學功能。

圖1 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異表達蛋白火山圖

圖2 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異蛋白熱圖

2.2 普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠心臟組織差異蛋白的GO富集分析

根據GO分析對基因的注釋，對普通香煙組與金圣4號香煙組大鼠43個差異表達蛋白進行分子功能、細胞組分及生物學過程的分類，分析結果顯示分子功能富集主要涉及結構分子活動、NADPH綁定和細胞黏附分子結合等；細胞組分富集主要涉及細胞外空間、細胞外區域部分和細胞外區域等；生物過程富集主要涉及細胞激活、調節體液水平和血小板活化等。詳見圖3～5。

圖3 分子功能富集分析結果

圖4 細胞組分富集分析結果

圖5 生物過程富集分析結果

2.3 差異蛋白的KEGG富集分析

對普通卷煙和金圣4號香煙煙氣暴露3個月組大鼠心臟組織差異蛋白進行KEGG富集分析，得到蛋白質在細胞中的代謝途徑以及這些蛋白質的功能差異，差異蛋白涉及血小板活化、補體和凝血級聯、氮代謝、半乳糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、果糖和甘露糖代謝等6個生物學通路。見表4和圖6。

表4 煙氣染毒干預3個月后兩組大鼠心臟組織差異蛋白的生物學通路

圖6 煙氣染毒3個月后兩組大鼠心臟組織差異蛋白的生物學通路

2.4 蛋白相互作用分析

基于OmicsBean組學數據整合分析云平臺，進行了差異蛋白及KEGG通路之間的蛋白互作分析，分析得到蛋白互作匯總結果。KEGG富集結果中顯著性前十的通路以及與之互作的蛋白之間的互作網絡圖，結果見圖7。

3 討論

在我國，心腦血管疾病的發病率和死亡率居高不下，占居民疾病死亡構成的40%以上。研究表明，吸煙可引起心血管系統的損傷，增加心血管發病的風險[1]。研究顯示，損傷作用機制可能與吸煙對血液中的血小板黏性的改變有關，血小板黏性增加可導致冠脈血栓的形成，從而增加心肌梗死的發病率，此外，血小板在冠心病中冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成導致猝死中起重要作用[7]。

圖7 蛋白相互作用網絡圖

本草香是中國醫藥史中一類具有多種功效的香藥，見載于《本草綱目》等重要本草典籍，研究表明，本草香藥除能產生良好的香味刺激外，還能促進機體免疫球蛋白含量提高，進而增強人體防御疾病的能力[6]，本文旨在研究本草香的生物學功效。通過采用GO和KEGG數據庫對吸煙組43個差異蛋白進行生物信息學分析，結果顯示，在吸煙后3個月蛋白表達的改變涉及到多種分子功能、細胞組分及生物學過程的變化，主要包括結構分子活動、血小板活化、血液凝固、細胞外空間等。

我們篩選出與脂蛋白的轉化與代謝過程有關的載脂蛋白E(ApoE)，ApoE是一種多態性蛋白，其濃度與血漿甘油三酯含量呈正相關。研究表明，ApoE基因多態性與血脂異常以及冠狀動脈粥樣硬化的關系密切，其中ApoE4型是冠心病發生的重要影響因子[8]。差異表達基因的KEGG富集分析的結果顯示，差異表達蛋白涉及6個生物學通路，主要有血小板活化、補體和凝血級聯及代謝功能等。血小板活化是動脈粥樣硬化血栓的標志特征之一，血小板活化后會發生血小板聚集率增加，氧自由基，血栓素以及血小板活化因子合成明顯增加，同時在冠心病的發病中也起著重要作用[9]。凝血與補體級聯反應信號通路中有多種與疾病相關的炎癥或免疫類差異蛋白，這些蛋白各自執行生理功能，且又相互聯系[10]，該信號通路上的差異蛋白點可以作為本草香發揮作用的關鍵靶點。除此之外，差異表達蛋白還涉及氮代謝以及糖代謝途徑。

本研究主要觀察了兩種香煙干預3個月后大鼠心臟組織蛋白表達的變化，篩選出差異蛋白，這些蛋白多數與血小板活化、補體和凝血級聯和代謝等生物學途徑相關。表明本草香干預對心血管系統的影響涉及多個蛋白及生物學過程，是一個復雜且相互影響的過程，此次篩選出的相關結果將為進一步研究普通香煙組大鼠與金圣4號香煙組造成的差異表蛋白以及作用機制提供研究線索，為研究本草香的生物學功效提供研究幫助。