GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中LINC00472的表達及其意義

謝廣云，郭浩然，王全凱 ，馬順鵬，宋佳陽，烏瀚寶櫟爾，許建寧，*

(1.中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所，北京 100050；2.江陰市疾病預防控制中心，江蘇 無錫 214434；3.中國疾病預防控制中心化學污染與健康安全重點實驗室，北京 100050)

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)LINC00472位于人類染色體6q13基因間區，又叫做P53相關LncRNA(P53 related LncRNA，P53RRA)。研究發現，LINC00472的表達水平與乳腺癌、上皮性卵巢癌的發生發展密切相關，其中LINC00472高表達乳腺癌患者的治療效果和生存時間都要優于低表達的患者[1-2]。而LINC00472在細胞惡性轉化過程中的表達變化情況及作用機制未見報道。

甲基丙烯酸環氧丙酯(glycidyl methacrylate，GMA)，又稱甲基丙烯酸縮水甘油酯，主要用于高分子材料(樹脂、涂料、膠黏劑、活性稀釋劑等)的加工與合成，具有良好的防紫外線、耐水和耐熱等特性[3-4]。本課題組研究發現，GMA具有致癌危險性，可誘發BALB/C 3T3細胞、SHE細胞、KMB-13細胞、16HBE細胞等不同類型的細胞發生惡性轉化[5]。

本研究采用LncRNA芯片分析技術，篩選出在GMA誘導的人支氣管上皮細胞惡性轉化的前、中、后期差異表達的LncRNA——LINC00472，通過生物信息學手段尋找其可能作用的靶基因，實時熒光定量PCR(qPCR)驗證LINC00472及其靶基因的表達水平，探討其在細胞惡性轉化過程的表達特點及意義。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

甲基丙烯酸縮水甘油酯(純度≥98.5%)，購于美國陶氏化學公司；二甲基亞砜(DMSO)，購于Sigma公司；胰蛋白酶、EDTANa2，均購于美國Amresco公司；MEM培養基粉，購于美國Hyclone公司；標準胎牛血清(FBS)，購于天津灝洋生物制品公司；青鏈霉素混合液(100×)，購于北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑，購于上海碧云天生物技術有限公司，2X PCR master mix，購于美國Arraystar公司。

CO2培養箱，購于美國Thermo公司；臺式高速低溫離心機，購于Heraeussepatech公司；紫外可見分光光度計(UV-2800H)，購于美國UNICO公司；7900HT Fast Real-Time PCR儀，購于美國Biosystems公司；凝膠成像系統，購于上海天能科技有限公司；ND-1000分光光度計，購于美國NanoDrop公司；ViiA 7實時定量PCR反應體系，購于美國Applied Biosystems公司；Arraystar Human LncRNA Microarray V4.0芯片技術服務和引物設計的技術支持由上海康成生物公司提供。

1.2 細胞培養與轉化

人支氣管上皮細胞(16HBE)為SV40 largeT抗原永生化的人支氣管上皮細胞系，由美國加利福尼亞大學傳出。使用含10%標準胎牛血清、青鏈霉素混合液(100倍稀釋)的MEM培養液，于37℃、CO2體積分數為5%的恒溫培養箱中培養。取對數生長期的細胞，每瓶接種約5×105個，培養24 h后使用8 μg/mL的GMA進行染毒處理(DMSO作為溶劑對照)。每次染毒時間為72 h，間隔24 h后進行再次染毒，共處理3次，此時記為第1代，繼續傳代培養至第30代，觀察并記錄細胞的生長及形態學變化。采用刀豆蛋白A(ConA)凝集實驗和錨著依賴性(軟瓊脂)實驗在細胞轉化的前、中、后期鑒定細胞生物學特征。

1.3 LncRNA芯片分析

分別收集培養至第10、20、30代的GMA染毒組和DMSO對照組細胞，采用TRIzol提取總RNA，并使用RNase-Free DNase I和RNAclean Kit離心柱型純化試劑盒對其進行純化，去除可能存在的DNA污染。通過ND-1000分光光度計測得的不同波長下的吸光度值評估總RNA的純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用Agilent Quick Amp Labeling Kit標記逆轉錄生成的cDNA，在Agilent SureHyb雜交儀中將其與LncRNA芯片進行雜交，并使用NanoDrop檢測熒光標記效率，以保證后續芯片結果的可靠性。

通過Arraystar RNA Flash Labeling Kit對樣品進行標記后，使用Agilent SureHyb進行雜交實驗，芯片洗滌后，Agilent DNA Microarray Scanner掃描信號值。經過芯片標準化處理，得到LncRNA的表達變化情況。以LncRNA相對表達量的差異倍數＞2為篩選標準，篩選第10、20、30代均出現差異變化的基因，通過做qPCR驗證其在細胞中的表達情況，并查閱文獻及DIANA TOOL、NCBI BLAST等生物信息學分析手段預測LINC00472作用的靶基因和可能存在的生物學功能。

1.4 qPCR檢測LINC00472和miR-24-3P的表達水平

用逆轉錄試劑盒將提取純化后的總RNA樣品逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行定量PCR反應。反應體系包括：上下游引物各0.5 μL、2×Master Mix 5 μL、cDNA模板2 μL及RNase-free水2 μL；反應條件為：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，95℃延伸15 s，共40個循環。分別以管家基因β-actin和U6為內參，以同代溶劑對照組細胞表達水平的均值為基準，采用2-ΔΔCT計算的相對表達水平。管家基因及目的基因的引物序列見表1。

表1 qPCR基因引物序列

1.5 統計學方法

采用SPSS20.0軟件進行統計分析，GMA染毒組和DMSO對照組間的基因表達水平的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較選用SNK檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 LINC00472在16HBE細胞惡性轉化過程中表達情況的芯片分析結果

隨著GMA誘導16HBE細胞惡性轉化的完成，與同期對照組相比，GMA組ConA凝集的速度明顯加快，并在第30代軟瓊脂試驗中形成集落。按照設定的篩選標準，共有72個差異LncRNA符合要求，其中LINC00472在GMA誘導16HBE細胞惡性轉化各個時期表達情況的芯片分析結果見圖1。與同代DMSO對照組相比，LINC00472表達水平在細胞轉化的前期、中期和后期分別下調2.30倍、下調3.57倍和上調2.32倍。在16HBE細胞惡性轉化過程中，3個時期DMSO對照組中LINC00472的相對表達水平(校正信號值)逐漸下調，而GMA染毒組前期和中期先逐漸下調，而在后期表現為上調。

圖1 GMA處理組和DMSO對照組16HBE細胞LINC00472的變化情況

2.2 LINC00472在16HBE細胞惡性轉化過程中表達情況的qPCR檢測結果

qPCR驗證的結果顯示，與同代齡DMSO對照組相比，第10、20和30代GMA染毒組細胞的LINC00472相對表達水平分別為1.07±0.07、0.364±0.04、2.34±0.44(圖2)。其中第20、30代染毒組的相對表達水平變化方向與芯片結果一致，且與對照組相比，兩組之間的差異具有統計學意義(P＜0.05)。此外，3個時期的GMA染毒組之間LINC00472的相對表達水平也存在統計學差異(P＜0.05)。

圖2 LINC00472的qPCR驗證結果

2.3 LINC00472在16HBE細胞惡性轉化過程中的靶基因預測及靶基因的qPCR驗證結果

為進一步研究LINC00472的生物學功能，通過查閱有關文獻及生物信息學數據庫信息[6]，得到miR-24-3p很可能是LINC00472的一個作用靶基因，LINC00472和miR-24-3p的結合位點見圖3。miR-24-3p的qPCR檢測結果顯示，與同代齡DMSO對照組相比，GMA染毒組細胞的miR-24-3p在第10、20、30代時的相對表達水平分別為1.35±0.03、0.82±0.05、1.43±0.16，兩組的相對表達水平具有統計學差異，但其差異倍數均未超過2倍。

圖3 LINC00472和miR-24-3p的結合位點

3 討論

LncRNA是一類長度超過200個核苷酸的不具有蛋白質編碼功能的RNA分子。起初lncRNAs被認為在人類生理過程中不發揮作用。但近年來研究表明，LncRNA雖然不直接參與基因編碼和蛋白質合成，但在染色體沉默、染色質修飾、轉錄激活和轉錄干擾發揮著非常重要的功能[7]。越來越多的研究發現，LncRNA與人類癌癥的發生發展密切相關[8]，但在化學物質的誘導細胞惡性轉化的機制研究中鮮有報道。

Luo等[9]研究發現，LncRNA MALAT1在PM2.5誘導人支氣管上皮HBE和BEAS-2B細胞致瘤性轉化中高表達，隨著細胞惡性轉化的完成，其相對表達水平的改變呈上升趨勢，進一步研究發現LncRNA MALAT1通過與miR-204相互作用，在細胞惡性轉化過程中發揮“致癌基因”作用。在本研究中，我們通過對GMA誘導16HBE細胞惡性轉化的第10、20和30代的高通量芯片結果進行篩選分析，發現LINC00472的表達水平由轉化初期的逐步下調到轉化后期的上調，這一動態改變提示LINC00472可能在細胞惡性轉化過程中發揮作用。

LINC00472作為16號染色體基因間區發現的長鏈非編碼RNA，Zou等[10-11]研究發現，LINC00472與非小細胞肺癌、肺腺癌患者中低表達，其中在非小細胞肺癌中通過激活P53信號通路，進而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，表明LINC00472在肺癌中發揮抑癌基因的作用。此外，LINC00472被發現在人類結腸直腸癌中也發揮重要作用[12]。本研究通過LncRNA芯片和qPCR技術檢測了LINC00472在GMA誘導的16HBE細胞惡性轉化過程的表達改變。結果表明，第10代對照組和GMA染毒組相對表達水平的差異無統計學意義，第20、30代的驗證結果與芯片分析結果一致，相對表達水平呈現由低到高的變化趨勢。我們推測LINC00472在GMA誘導的16HBE細胞惡性轉化早期其作用被抑制，隨著轉化的完成開始發揮抑癌基因的作用。

越來越多的研究表明，微RNA(microRNA，miRNA)可以直接調節靶基因的表達，從而影響人類腫瘤的發生、發展和轉移。而LncRNA可以作為miRNA的內源性競爭RNA和海綿體，間接參與調控miRNA的下游靶基因[13]。Chen等[14]在肝癌的研究中發現，肝癌和正常組織的LncRNA表達水平存在差異，LINC00472在癌組織中表達顯著下調，且表達水平低的患者預后水平較差，進一步研究發現LINC00472的表達水平與miR-93-5P呈負相關，miR-93-5P能夠特異結合LINC00472，靶向調節LINC00472使其表達減少，進而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力。本研究中通過查閱有關文獻和生物信息學分析，發現LINC00472和miR-24-3p之間存在堿基結合位點，預測在GMA誘導細胞惡性轉化過程中，miR-24-3p可能與LINC00472共同發揮作用。然而miR-24-3p的qPCR驗證結果顯示，與同期DMSO對照組相比，第10、20和30代GMA染毒組細胞相對表達水平的差異倍數均未超過2倍，變化趨勢與LINC00472一致，而miRNA普遍作為內源性競爭RNA分子結合LncRNA共同發揮作用[15]。因此，LINC00472和miR-24-3p在此過程中是否存在相互作用以及其作用機制有待進一步研究。

綜上所述，在GMA誘導16HBE細胞惡性轉化過程中，芯片分析和實時定量PCR的結果表明，LINC00472在轉化中期低表達，轉化后期高表達，推測LINC00472可能在GMA誘導16HBE細胞惡性轉化后期發揮作用，但是否通過結合miR-24-3p參與調控這一過程，還有待進一步研究。