shRNA 干擾TTF- 1 基因?qū)Ψ蜗侔┘?xì)胞EGFR- TKI 敏感性及細(xì)胞上皮間質(zhì)化的影響

呂昕 周林水 陳瑞琳 楊珺超 王真

肺腺癌是肺癌中最常見的組織亞型，靶向治療是治療肺腺癌的重要手段，其中表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor -tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治療非小細(xì)胞肺癌效果肯定[1]。研究發(fā)現(xiàn)EGFR-TKI 治療肺腺癌的療效不僅與EGFR 基因突變相關(guān)，也與腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)（上皮間質(zhì)化在EGFR-TKI 產(chǎn)生耐藥過程中發(fā)揮了重要作用）[2]。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（thyroid transcription factor-1，TTF-1），又稱甲狀腺特異增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（Nkx2-1），是Nkx2 基因家族中的一個(gè)包含同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，高表達(dá)于肺腺癌組織，多項(xiàng)研究表明TTF-1 表達(dá)與EGFR 突變存在相關(guān)性，可部分預(yù)測EGFR-TKI 的治療效果[3]，但兩者具有相關(guān)性的分子機(jī)制及兩者與肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化的相關(guān)性尚不明確。吉非替尼為EGFR-TKI代表性藥物之一，在臨床廣泛應(yīng)用，因此本研究以吉非替尼敏感、TTF-1 高表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞株HCC827 為細(xì)胞模型，探討TTF-1 是否能通過干預(yù)肺癌細(xì)胞EMT 進(jìn)而參與調(diào)節(jié)吉非替尼藥物敏感性及其可能的分子機(jī)制，為臨床EGFR-TKI 耐藥的防治提供新的治療策略。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器 HCC827（美國American Type Culture Collection 公司）、FBS（美國GIBCO 公司）、RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司）、DEME 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司）、CCK-8 試劑盒（日本同仁公司）、E-鈣黏蛋白C（E-cadherin，批號：YT1415，美國ImmunoWay 公司）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）（批號：GTX10095，美國Gene Tex 公司）、TTF-1（批號：SC13040，美國Santa cruzbio technlology 公司）、羊抗兔辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號：A0208，中國碧云天公司）、吉非替尼（批號：YY14627-1g，純度≥99%，上海源葉生物科技有限公司）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）（批號：1012209-1，美國Peprotech 公司）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、生物安全柜（蘇州金凈凈化設(shè)備公司）、電泳儀mini protean 3 cell（美國BIO-RAD 公司）、電轉(zhuǎn)儀PS-9（大連競邁科技有限公司）、酶標(biāo)儀MK3（芬蘭雷勃酶標(biāo)儀）、移液器（德國吉爾森P 型移液器公司）、基因轉(zhuǎn)染6孔板（美國Costa 公司）、pRNAi-U6.2/lenti 載體、限制性內(nèi)切酶XhoI 和HpaI（上海NEB 公司）、LipofectAMINE 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（批號:11668-019，美國Invitrogen 公司）。

1.2 shRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建 靶向TTF-1 的特異性干擾序列為5′-GACGCUUCAAGCAACAGAA- 3′，陰性對照序列為5′-CGUUCUCAGUGUCUGACAU- 3′。將目的片段插入pRNAi-U6.2/lenti 載體的XhoI 和HpaI 位點(diǎn)，分別構(gòu)建 pRNAi-U6.2/lenti-TTF-1-GEP-shRNA 和pRNAi-U6.2/lenti-NC-GEP-shRNA，作為陽性干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，進(jìn)行陽性克隆篩選并鑒定（圖1）。

圖1 pRNAi-U6.2/lenti 載體圖譜

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將對數(shù)生長HCC827 細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化后加入含10%FBS 的37℃的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，以9×105個(gè)/ml 細(xì)胞種于75T 培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞生長融合至70%～80%，用無血清培養(yǎng)基饑餓24h，使細(xì)胞靜止于同步期。

1.4 細(xì)胞分組 將HCC827 細(xì)胞分成空載體組、陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（NC-shRNA）組和陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染（TTF-1-shRNA）組。基因轉(zhuǎn)染6 孔板內(nèi)每孔種植2.0×10s HCC827細(xì)胞（1～8ml 含血清培養(yǎng)基），培養(yǎng)24h。按照LipofectAMINE2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染：取3 組不同表達(dá)質(zhì)粒10μg，按照1∶2 的比例加入轉(zhuǎn)染試劑，將DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合液溫育10min 后，再補(bǔ)充轉(zhuǎn)染試劑至總體積達(dá)100μl，將其加至各組的HCC827 細(xì)胞中。37℃孵育48h 后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達(dá)情況，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)×100%。分選細(xì)胞，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。空載體組不做處理。

1.5 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期各時(shí)相所占百分比檢測 將培養(yǎng)好的不同組別細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，充分吹打，1 000r/min 離心5min，棄上清液，細(xì)胞沉淀用100μl濃度為1mg/ml 的RNase A 溶液懸浮，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化細(xì)胞內(nèi)的RNA，加入將400μl 濃度為50μg/ml 的碘化丙啶（PI）溶液，避光染核10min。隨即使用流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光，對細(xì)胞DNA 含量進(jìn)行測定，進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析：四象限中P2-UL 代表壞死細(xì)胞，P2-UR 代表晚期凋亡細(xì)胞，P2-LR 代表早期凋亡，P2-LL 代表未發(fā)生凋亡的細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率為P2-UR 與P2-LR 百分率之和。計(jì)算各細(xì)胞周期G0/G1 相、S 相、G2/M 相所占百分比，確定細(xì)胞在各個(gè)時(shí)相的分布狀態(tài)，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.6 細(xì)胞生長抑制率檢測 采用CCK-8 法。將轉(zhuǎn)染24h 的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后計(jì)數(shù)，以1×105/ml 細(xì)胞密度，接種于96 孔板，每孔100μl。待細(xì)胞長至80%～90%時(shí)加入不同濃度的吉非替尼（10、20、40、60μmol/ml），每孔設(shè)6 復(fù)孔，外周孔空置設(shè)僅含培養(yǎng)基的空白對照。藥物作用72h 后每孔加入10μlCCK-8，孵育2h，酶標(biāo)儀測450nm 吸光度A 值。空白對照細(xì)胞活力設(shè)為1。按公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率（%）=1-細(xì)胞活力%=1-[（A 加藥）-（A 空白）]/[（A0 加藥）-（A 空白）]×100%。其中A 加藥指具有細(xì)胞、CCK-8 溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A空白指具有培養(yǎng)基和CCK-8 溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；A0 加藥指具有細(xì)胞、CCK-8 溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

1.7 TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)化 予高濃度5ng/ml TGF-β1作用于各組細(xì)胞，連續(xù)48h 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化至發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由原有上皮細(xì)胞的鵝卵石狀變?yōu)樗笮尾⒗^續(xù)變細(xì)長，部分細(xì)胞可見軸突樣結(jié)構(gòu)，完全演變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，提示細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)化。

1.8 TTF-1、E-cadherin 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。取培養(yǎng)細(xì)胞，PBS 洗滌，吸去培液，適量預(yù)冷的1×PBS 洗滌2 次，吸去PBS，采用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 法測定總蛋白含量，定量后貯存于-80℃冰箱，將蛋白裂解液溶解在等量的2×樣品緩沖液中100℃加熱5min，蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，聚偏氟乙烯膜（PVDF）進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將膜放入封閉液（5%脫脂奶粉）中室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜，TBST 漂洗5min×3，轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂奶粉封閉1h，將膜放入封閉液（5%脫脂奶粉）中室溫封閉1h，加入一抗4℃孵育過夜，稀釋HRP 標(biāo)記的二抗，與膜37℃孵育1h，TBST 漂洗5min×3，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）進(jìn)行顯色反應(yīng)，用光密度掃描儀記錄，圖像分析軟件進(jìn)行分析，以GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組內(nèi)不同濃度吉非替尼作用后細(xì)胞生長抑制率的比較采用重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期各時(shí)相所占百分比的比較 3 組細(xì)胞凋亡率之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，與NC-shRNA 組、空載體組比較，TTF-1-shRNA 組細(xì)胞凋亡率均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而空載體組與NC-shRNA 組比較，細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2（插頁）、表1。3 組細(xì)胞周期G0/G1 相、S 相和G2/M 相所占百分比之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，與NCshRNA 組、空載體組比較，TTF-1-shRNA 組細(xì)胞周期中G0/G1 相所占百分比均升高，S 相和G2/M 相所占百分比均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而空載體組與NC-shRNA 組比較，細(xì)胞周期各時(shí)相所占百分比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3（插頁）、表1。

圖2 Annexin V/PI 雙染法分析細(xì)胞凋亡

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化

2.2 不同濃度吉非替尼作用后3 組細(xì)胞生長抑制率的比較 不同濃度吉非替尼作用后，每組細(xì)胞的生長抑制率均隨藥物濃度的增加而升高，不同濃度間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同一濃度時(shí)，3 組細(xì)胞生長抑制率之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TTF-1-shRNA組較NC-shRNA 組、空載體組均明顯為高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而空載體組與NC-shRNA 組比較，僅在吉非替尼20μmol/ml差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 3 組細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期各時(shí)相所占百分比的比較（%）

2.3 TGF-β1誘導(dǎo)HCC827 細(xì)胞上皮間質(zhì)化后細(xì)胞形態(tài)變化 觀察細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由原有上皮細(xì)胞的鵝卵石狀變?yōu)樗笮尾⒗^續(xù)變細(xì)長，部分細(xì)胞可見軸突樣結(jié)構(gòu)，完全演變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，提示細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)化，見圖4（插頁）。

圖4 TGF-β1 誘導(dǎo)HCC827 細(xì)胞上皮間質(zhì)化后細(xì)胞形態(tài)變化（×150）

2.4 3 組細(xì)胞TGF-β1作用前后TTF-1、α-SMA、Ecadherin 蛋白表達(dá)水平比較 TGF-β1作用前后，3 組細(xì)胞TTF-1、α-SMA、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，與空載體組和NCshRNA 組比較，TGF-β1作用前后，TTF-1-shRNA 組細(xì)胞TTF-1、α-SMA 蛋白表達(dá)水平均為降低，E-cadherin蛋白表達(dá)水平均為增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與TGF-β1作用前比較，TGF-β1作用后NCshRNA 組和空載體組TTF-1、E-cadherin 蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與NC-shRNA組、空載體組比較，TTF-1-shRNA 組TGF-β1作用前后細(xì)胞E-cadherin、α-SMA 蛋白變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5、表3。

圖5 TGF-β1 作用前后3 組TTF-1、α-SMA、E-cadherin 蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

TTF-1 是NKX2-1 家族的成員，最早發(fā)現(xiàn)與甲狀腺的功能及相關(guān)疾病有關(guān)，在肺組織中主要在Ⅱ型肺泡上皮和無纖毛的支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)，TTF-1作為肺腺癌的重要免疫標(biāo)記已在臨床病理診斷中廣泛應(yīng)用[4]。多項(xiàng)研究表明TTF-1 與EGFR 突變存在相關(guān)性[5-7]。2011 年ASCO 會(huì)議報(bào)道：TTF-1 陰性表達(dá)的肺腺癌，EGFR 突變率非常低，提示TTF-1 可以預(yù)測EGFR 突變，TTF-1 的表達(dá)情況不僅與肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKI的敏感性存在聯(lián)系[8]，也與肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化存在相關(guān)性[9]。上皮細(xì)胞間質(zhì)化（EMT）與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤藥物的原發(fā)耐藥與獲得性耐藥過程中也發(fā)揮了重要作用，有研究表明E-cadherin 表達(dá)的上皮表型肺癌細(xì)胞對EGFR-TKI 敏感性高[10]。TGF-β1是調(diào)控EMT 的“主開關(guān)”并已被證明主要通過2/3 SMAD 信號通路完成，且不受其他通路影響[11]。

表2 不同濃度吉非替尼作用后3 組細(xì)胞生長抑制率的比較（%）

表3 TGF-β1 作用前后TTF-1、α-SMA、Eca 蛋白的表達(dá)

本研究以吉非替尼敏感、TTF-1 高表達(dá)、E-cadherin表達(dá)的上皮表型肺腺癌HCC827 細(xì)胞為研究對象，結(jié)果顯示干擾沉默TTF-1 基因后，肺癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1 期，腫瘤細(xì)胞生長抑制率顯著高于對照組，腫瘤細(xì)胞對吉非替尼敏感性較對照組顯著增加，腫瘤細(xì)胞上皮表型E-cadherin 蛋白表達(dá)增高，間質(zhì)表型α-SMA 蛋白表達(dá)下降。與對照組比較，TGF-β1作用后，干擾沉默TTF-1基因的細(xì)胞E-cadherin、α-SMA 蛋白變化不明顯，提示細(xì)胞上皮間質(zhì)化部分被抑制。本研究證實(shí)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性TTF-1 表達(dá)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）與EGFR-TKI 敏感性有著密切關(guān)系，TTF-1 表達(dá)率高、上皮表型蛋白表達(dá)率高均提示對EGFR-TKI 敏感性高。

TTF-1 基因在本研究中呈雙作用，有學(xué)者用Fisher精確檢驗(yàn)分析顯示TTF-1 陽性表達(dá)與EGFR 外顯子21突變存在強(qiáng)相關(guān)性[12]，而筆者所用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株HCC827，前期經(jīng)NGS 法檢測顯示其存在EGFR 外顯子19 突變。因此，我們推測EGFR 不同突變與TTF-1、EMT 相關(guān)性在機(jī)制上存在差異：沉默EGFR 外顯子19 突變表達(dá)肺癌細(xì)胞HCC827 的TTF-1 基因后，間質(zhì)標(biāo)志蛋白α-SMA 表達(dá)下降，上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin 表達(dá)上升，部分減輕TGF-β1誘導(dǎo)的HCC827 細(xì)胞上皮間質(zhì)化的過程，增加了EGFR-TKI 的敏感性，具體相關(guān)機(jī)制及作用位點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。