硒代半胱氨酸生物合成研究進展

何家偉，杜 馨，蔡 俊*

（湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室 工業發酵湖北省協同創新中心工業微生物湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430068）

硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）是蛋白質中硒的主要存在形式，也是唯一含有準金屬元素的氨基酸[1]。Sec被稱為第21種氨基酸[2]，作為活性中心存在于谷胱甘肽過氧化酶、硫氧還蛋白還原酶、甘氨酸還原酶、甲酸脫氫酶等含硒酶中。其在合成高活性硒化物，生產富硒食品，醫藥保健方面有著巨大潛力。如硒代半胱氨酸的甲基化衍生物硒甲基半胱氨酸（methyl selenocysteine，SeMcys）是一種有著良好抗癌前景的物質。硒甲基半胱氨酸具有補硒、防治癌癥、抗氧化、抗衰老、治療心腦血管疾病、解重金屬毒等作用[3]。硒代半胱氨酸是多種低分子硒代多肽類物質的組分[4]。包含硒代半胱氨酸殘基的蛋白稱為硒蛋白[5]。含有硒代半胱氨酸的硒蛋白有多種重要作用[6]，是人和動物體內是不可缺少的關鍵物質，大規模生產硒代半胱氨酸有著良好的市場效益。目前可利用化學法和生物法合成硒代半胱氨酸。

1 化學法合成硒代半胱氨酸

化學法合成硒代半胱氨酸先用氯丙氨酸（C3H6ClNO2）與二硒化鈉（Na2Se2）反應生成硒代胱氨酸（SeC），然后用金屬鈉/液氨在-70 ℃的條件下將硒代胱氨酸還原裂解成硒代半胱氨酸[7]。該方法中的化學反應需在-70 ℃的條件下進行，且需用到性質活潑的金屬鈉，反應條件苛刻，工藝設備要求高，氯丙氨酸原料價格高，生產成本高，很難投入大規模的生產中。

2 生物法合成硒代半胱氨酸

植物、動物、微生物均能合成硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸在生物體內合成需要依賴復雜的轉移核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）合成機制[8]，其tRNA起初由絲氨酸-tRNA連接酶加載絲氨酸（serine，Ser），但其無法被普通的翻譯因子識別。該絲氨酰可被含有磷酸吡哆醛的硒代半胱氨酸合成酶替換為硒半胱胺酰。然后Sec-tRNA與硒特異延伸因子（SelB或mSelB）結合，通過核糖體翻譯該mRNA。無機硒通過硫的合成途徑，傳遞到核糖體，并插入到新生的硒蛋白[9]。生物法合成硒代半胱氨酸相較于化學法，反應相對溫和，材料成本低廉，大規模生產方面更具前景。

2.1 植物合成硒代半胱氨酸及檢測提取方法

植物硒的主要來源是土壤中的硒。六價硒被吸收進入植物葉綠體細胞后在谷胱甘肽和5-磷硫酸腺苷（adenosine 5-phosphosulfate，APS）的作用下轉化為四價硒，然后在植物葉綠體內經過半胱氨酸合成酶（cysteine synthase，CSase）的作用轉化成硒代半胱氨酸[10]。植物中硒代半胱氨酸合成效率較低，應用于實際生產較為困難。不同植物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測方法見表1。

表1 不同植物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測方法Table 1 Extraction and detection methods of selenocysteine from different plants

2.2 動物合成硒代半胱氨酸及檢測提取方法

動物合成硒代半胱氨酸的途徑與微生物合成硒代半胱氨酸途徑相同，但動物體內硒的轉化效率和硒代半胱氨酸合成效率較低，提取手段較為復雜。在哺乳動物中，比較基因組學和實驗分析表明哺乳動物的硒代半胱氨酸合成酶（selenocysteine synthetase，Secs）是含吡咯磷酸鹽（pyrrole phosphate）的蛋白質[16]，被稱為可溶性肝抗原。硒代半胱氨酸合成酶需要磷酸硒和膦酰-tRNA[Ser]Sec作為底物產硒代半胱氨酸-tRNA[Ser]Sec[17]。此外，在由硒化物、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和絲氨酸組成的tRNA支架上，用tRNA[ser]sec、seryl-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase）、膦酰-tRNA[Ser]SEC激酶（phosphonoy-tRNA[Ser]Seckinase）、激酶磷酸硒合成酶、硒代半胱氨酸合成酶在tRNA支架上合成了硒代半胱氨酸[18]。不同動物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測方法見表2。

表2 不同動物來源的硒代半胱氨酸提取及檢測方法Table 2 Extraction and detection methods of selenocysteine from different animals

2.3 微生物合成硒代半胱氨酸

圖1 釀酒酵母硫硒氨基酸生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis of sulfur amino acid in Saccharomyces cerevisiae

硒酸鹽在還原酶的作用下與氨基酸結合成硒代氨基酸再參與生物體代謝，主要生成硒蛋白和含硒酶類。硒與硫在微生物中的代謝途徑和是相似的，均使用同一個絲氨酸代謝途徑[25]。圖1顯示了硒進入微生物體內后的代謝和硒代蛋氨酸（selenomethionine，SeMet）轉化為硒代半胱氨酸途徑，以及硒代半胱氨酸合成硒代甲基半胱氨酸和谷胱甘肽途徑。硒化氫（H2Se）與O-乙酰絲氨酸（O-acetyl serine，OAS）在同型半胱氨酸合成酶作用下合成同型硒半胱氨酸，在蛋氨酸合成酶作用下合成硒代蛋氨酸。同型硒半胱氨酸與絲氨酸在半胱氨酸-β-合成酶作用下生成硒代胱硫醚，然后在胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase）的作用下生成硒代半胱氨酸（SeCys）。

硒代半胱氨酸的合成與selA、selB、selC、selD四個基因的產物相關[26]。SelC是一個特異性的硒代半胱氨酸-tRNASec，在進行翻譯時，SelC會被氨?；?，在Seryl-tRNA合成酶催化完成反應，同動物硒代半胱氨酸合成途徑相似，形成SertRNASec提供了基本的碳骨架來生成硒代半胱氨酸[27]。

2.4 常用硒代半胱氨酸檢測方法優缺點比較

比色法、熒光分光光度法、氫化物-原子熒光法、火焰原子吸收法、氫化物-原子吸收法、石墨爐-原子吸收法、催化動力學光度法、高效液相色譜法和電感耦合等離子體質譜法[28]是常用測定總硒含量的方法。但上述方法并不能完全有效的檢測硒代半胱氨酸，需對硒代半胱氨酸進行高效的分離提取，并與檢測方法聯用對硒代半胱氨酸進行測定。硒代半胱氨酸檢測提取方法及優缺點見表3。

表3 硒代半胱氨酸檢測方法優缺點Table 3 Advantages and disadvantages of detection methods for selennocysteine

3 微生物發酵生產硒代半胱氨酸進展

動、植物生產硒代半胱氨酸成本高，且受季節、地域、氣候的限制。而微生物生長速度快，原料經濟廉價，便于培養，產出效率高，可通過控制培養條件提高產量，故利用微生物生產硒代半胱氨酸。

3.1 富硒菌種選育

硒代半胱氨酸的發酵生產需先選育出高耐硒性菌株。硒酸鹽或亞硒酸鹽作為添硒劑，均對菌種產生毒性并對菌體生長有抑制作用[29]，要想得到具有高硒積累能力的菌株，其在生長過程中需表現出較高的抗硒鹽能力[30]，故選育菌種需有一定的耐硒性。篩選過程前需對菌種的富硒能力進行評估，選用富硒能力強的菌株作為實驗菌株。菌種選育階段首先需考慮抗性篩選過程，對樣本菌種進行不同濃度硒的梯度培養，以達到初篩目的。微生物主要利用透性酶對硒吸收，已發現的細菌硫透性酶基因有cysA，cysU，cysW，以上基因發生突變將會提高硒的耐受性[31]。在此基礎上對具有耐硒能力的菌種繼續采用誘變育種的方式篩選。

富硒誘變育種通常采用紫外線照射或亞硝酸等誘變劑進行單因素誘變，王小波等[32]以富硒酵母Y2為出發菌株，通過60Coγ射線照射誘變育種，篩選獲得一株生物量和富硒能力都較高的突變菌株YR166，進行富硒培養后硒含量達到2 531.4 μg/g，較原菌株提高74.2%，酵母生物量達到14.9 g/L，較原菌株提高36.7%。復合誘變相對于單因素誘變過程更為復雜，但可以更有針對性的培育菌種，達到更好的誘變效果。曾禮華等[33]以熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis）1254為出發菌株進行了亞硝基胍誘變和亞硒酸鈉抗性篩選，紫外線誘變和乙硫氨酸抗性篩選等兩輪突變和篩選，獲得突變菌株1254-6-1，其生物量、總硒含量、有機硒的含量及轉化率分別達到7.60 g/L、5 626.00 μg/g、4 879.99 μg/g、86.74%，分別為原始出發菌株的1.85倍、7.90倍、9.35倍、1.18倍。富硒復合誘變流程如下：硒鹽抗性初篩→選出硒耐受性及富硒能力強的菌株→亞硝基胍誘變及硒鹽抗性復篩→進一步篩選富硒能力強的菌株→紫外誘變及乙硫氨酸抗性篩選→富硒菌株。以上步驟篩選出的菌株一般具有良好的抗硒性。從中繼續篩選硒代半胱氨酸產量高的菌株進行發酵優化。

3.2 硒代半胱氨酸發酵條件優化

通常有兩種硒源在實驗中被廣泛使用，亞硒酸鈉（Na2SeO3）和硒酸鈉（Na2SeO4），對于兩種不同價態的硒，硒代半胱氨酸產率也不同。兩種硒鹽對菌體的生長均有抑制作用，發酵培養過程中添加硒酸鈉能提高有機硒的產量。因為亞硒酸鈉不同于硒酸鈉，可與還原糖（如葡萄糖）反應生成單質Se[34]，而生物幾乎無法利用單質Se。

發酵過程中，由于硒與硫在菌體吸收過程中的競爭關系，富硒過程中需控制硫與硒的比值發酵。MAPELLI V等[34]在高硫硒比和低硫硒比的情況下對釀酒酵母進行發酵，發現只有在缺硫的情況下硒才會被完全消耗，但由于硒鹽對菌體的毒性，在缺硫條件下細胞會生長不良；在高硫硒比時，硒難以被菌體所吸收。合適的硫硒比在硒代半胱氨酸的發酵生產中尤為關鍵。酵母細胞在添加硒鹽后會導致細胞尺寸減小[35]，具體原因還有待研究。DHANJAL S等[36]發現隨著硒鹽濃度的增加，細菌細胞大小隨之減小。細胞大小和數量的減少在細胞形態上可歸因于高濃度有毒離子對生長細胞施加的脅迫。換而言之，單個細胞體積減小，它們的相對表面積更大，能更好地吸收環境脅迫條件下的營養物質。

發酵方式的選用對細胞營養吸收至關重要。補料分批發酵比其他發酵方式在調整營養物質濃度方面有更大的優勢。將常用碳源葡萄糖的濃度維持在適當的水平，應用于補料分批培養，以控制葡萄糖效應，提高細胞密度[37]。發酵過程中對發酵參數如酵母細胞產率、發酵效率、有機硒生產率、產量和消耗率、生物量、底物和硒代半胱氨酸的濃度等進行測定。其他因素包括蒸發氣體損失，pH值測定，消泡手段，生物量體積，樣品的提取，這些都是影響酵母生長的因素[38]。

4 展望

本文探討了硒代半胱氨酸的生物合成以及檢測提取方法。植物、動物、微生物中均能合成硒代半胱氨酸，但植物、動物中產硒代半胱氨酸效率較低，微生物較二者更適合生產硒代半胱氨酸。介紹了硒代半胱氨酸多種檢測提取方法。從菌種選育和發酵條件優化兩方面概述微生物發酵生產硒代半胱氨酸方法。需注意以下幾點：高耐硒性菌株的選育和誘變篩選方式選用，硒源、發酵方法的選取以及適當硫硒比對微生物產硒代半胱氨酸的影響。

微生物合成硒代半胱氨酸可以從以下幾個方面拓展：（1）Sec常與其二聚體（Seenocystine，Sec2）混淆，易導致硒代半胱氨酸無法被準確的定性和定量，該問題是Sec檢測方面值得深入研究內容。（2）在誘變育種基礎上能夠通過原生質體融合或基因工程的方法進一步提高菌種的耐硒性或是提高菌種產硒代半胱氨酸能力。（3）微生物利用硒代半胱氨酸產出相應高活性硒化物。硒代半胱氨酸可在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶的催化下，與谷氨酸可能發生反應生成谷氨酰硒半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶催化下該產物進一步與甘氨酸反應可能生成硒代谷胱甘肽。硒代谷胱甘肽（GSeH）是谷胱甘肽（glutathione，GSH）的硒類似物，氧化型硒代谷胱甘肽（selenoglutathione）是一種具有類似谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）抗氧化能力的物質[39]，其還原物硒代谷胱甘肽的抗氧化能力更強。

堅信隨著社會發展和研究深入，人們將會科學認識和了解硒代半胱氨酸以及其衍生物，基于微生物發酵生產相應高活性抗癌硒化物將越來越受人們青睞，在食品、醫療等方面具有良好的經濟效益和和社會效益。