一株醋酸菌的分離鑒定及冬棗醋發酵條件的優化

郭夢瑤，韓 燁*，李素燕

（天津大學 化工學院，天津 300350）

果醋是以水果或果品加工的下腳料為主要原料，經酒精發酵、醋酸發酵釀制而成的一種集營養食療為一體的新一代酸性調味品或飲料[1]。果醋的營養豐富，富含多種有機酸，人體所需的多種氨基酸、維生素及生物活性物質，起到促進血液循環、降血壓、調節體液酸堿平衡、抑制血糖升高、抗菌消炎和催眠鎮靜的作用[2-4]。

醋酸菌是能夠將酒精氧化為醋酸的一類微生物的總稱。醋酸菌對人及動物均無致病性，且大部分醋酸菌性狀優良，營養要求較簡單，環境適應能力強，可造成果實的細菌性腐敗，造成酒的酸化，產生氣味較溫和的有機酸，引起酒的變色與風味改變[5-6]。優良的醋酸菌菌種是影響果醋品質的重要因素。國內外果醋釀造專用醋酸菌大都為食醋菌種AS1.41（Acetobacter rancensvar.tubidans）和滬釀1.01（A.pasteurianussubsp.pasteurianus）等[7]。選育方法常用的有自然選育法或誘變育種法，但總體來看選育后的菌株產酸能力、耐酒精能力有限，而且發酵果醋形成的風味也不佳[8]，轉酸率高的菌株可以充分利用原料資源，節約成本，因此急需選育綜合性能優良，特別是轉酸率高的菌種。

冬棗也叫水果棗、冰糖棗，是目前棗中最高檔的鮮食品種。其營養豐富，含19種人體必需氨基酸，維生素A、維生素E，鉀、鐵、銅、硒等多種微量元素；同時，棗多酚、黃酮含量高，具有較強的抗氧化活性、調節血脂和防治腦血管疾病的功效，是天然的滋補佳品[9-11]。我國有悠久的果醋制作歷史，冬棗醋作為一種冬棗深加工產品，既具有冬棗特有的風味和營養價值，又兼有果醋的營養成分和保健功能，是一種新型的天然營養保健醋，具有廣闊前景[12]。柿子醋醅中含有多種優良醋酸菌菌種，產酸迅速，其生產的柿子果醋富含多種香氣、口感濃醇、回味深長，深受消費者喜愛[13]。本研究從傳統自然發酵柿子醋醅中分離鑒定一株產酸性能優異的菌株，并利用其進行冬棗醋的發酵，通過單因素和正交試驗對發酵條件進行優化，制得一款酸甜爽口的冬棗醋，為發掘利用醋酸菌資源，解決冬棗貯藏難的問題，開發營養、美味和具有保健功能的新型冬棗醋提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料和菌種

柿子醋醅：山西運城鹽湖區市場；奧爾蘭醋桿菌（Acetobacter orleanense）：國家菌種保藏中心CICC7001；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α：本實驗室保藏；活性干酵母粉：中法王朝葡萄酒廠。

1.1.2 化學試劑

FlukaTM果膠酶（20 U/mg）：德國霍尼韋爾公司；pUCm-T載體、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片斷凝膠回收試劑盒、TaqDNA聚合酶（5 U/μL）、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、DNA片段回收純化試劑盒：上海生物工程技術服務有限公司；標準分子質量核酸DNA Marker：北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

醋酸菌分離培養基：葡萄糖1%，酵母膏1%，體積分數95%的乙醇3%，0.5%瓊脂，2%CaCO3，pH 4.5。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

Hoyer-Frateur培養基：乙醇3%，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.01%，MgSO4·7H2O 0.025%，FeCl30.000 5%。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

葡萄糖酸試驗培養基：酵母膏3%，葡萄糖10%，K2HPO40.1%，MgSO40.035%，NaNO30.1%，KCl 0.025%，蛋白胨0.05%，瓊脂2%，CaCO32%。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ABI 2720聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Thermo 公司；GIS-2009紫外凝膠成像儀：上海Tanon公司；HZQ-X100恒溫振蕩培養箱：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；DHP-420電熱恒溫培養箱：天津中環實驗電爐有限公司；A-103多功能榨汁攪拌機：浙江順敬工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柿子醋醅中高產酸醋酸菌的篩選

采用稀釋涂布平板法[14]對柿子醋醅中的醋酸菌進行分離，稀釋至10-1、10-2和10-3濃度，將稀釋液涂布在醋酸菌分離培養基中，30 ℃、倒置培養3 d，鈣溶解圈直徑大的菌落相應產酸性能優良，從培養基中挑選菌落形態一致，透明圈直徑H與菌落直徑C的比值較大，具有生長優勢的單個菌落，在平板上多次劃線分離、培養，對菌株進行純化。將純化后的各菌株分別取一環接種于斜面分離培養基上，編號，并30 ℃條件下靜置培養3 d。按照文獻[15]中的FeCl3溶液法進行產酸定性實驗，篩選出產醋酸的單菌落菌株。

1.3.2 醋酸菌形態特征觀察

取一環篩選的菌株分別接種于分離培養基平皿上，30 ℃倒置培養3 d，觀察菌落特征，并將各菌株進行革蘭氏染色觀察其細胞形態，其運動性利用直針穿刺法進行觀察。

1.3.3 醋酸菌的生理生化特征的測定

接觸酶、氧化酶、吲哚、V-P、明膠液化、乙醇過氧化、甘油生酮、產5-酮葡萄糖酸鹽參考文獻[16，17]進行；以銨鹽為唯一氮源生長試驗：在Hoyer-Frateur培養基上接種斜面菌株并觀察生長情況；產葡萄糖酸試驗：取一環菌接種到葡萄糖酸試驗培養基，觀察是否有透明圈。按照參考文獻[15]中的中和滴定法進行菌株產醋酸能力的測定，取產酸能力最高的菌株進行后續實驗。對照菌株為醋化醋桿菌奧爾蘭亞種（A.orleanense）。

1.3.4 醋酸菌的分子生物學鑒定

（1）16S rDNA基因片斷的擴增

取分離得到醋酸菌菌株一接種環懸浮于50 μL ddH2O中混勻15 s，5 000 r/min離心1 min，取上清做模板。

上游引物：5'-GCT GGC GGC ATG CTT AAC ACA T-3'；

下游引物：5'-AACCACATGCTCCACCGCTTG-3'[18]。

PCR擴增反應體系（50μL）：上下游引物各1μL（10pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 2 μL，超純水35 μL，Taq酶1 μL。

PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環30次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

（2）醋酸菌16S rDNA基因序列分析

按片斷凝膠回收試劑盒和DNA片段回收純化試劑盒說明書進行PCR產物的回收及純化。按pUCm-T載體說明書進行PCR產物與pUCm-T Vector連接，16 ℃條件下下反應過夜。將連接產物送上海生工生物工程公司測序。

測序結果去除引物序列后在美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行Blast比對，選取同源性高的模式菌株的16S rDNA序列，采用MEGA 5 軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.5 冬棗醋發酵工藝流程及操作要點

冬棗選果、清洗→去核打漿→酶解→離心分離→澄清冬棗汁→成分調整→殺菌→冷卻→酒精發酵→醋酸發酵→過濾→殺菌→冬棗醋

操作要點：

選果、清洗、去核打漿：選擇新鮮、成熟的果實，剔除爛果，用清水清洗2～3次。去除棗核，將冬棗用榨汁機破碎打漿。立即將果汁用真空抽濾機過濾，并在95 ℃下滅酶30 s。

果膠酶酶解：果膠酶用量0.08%，酶解溫度50 ℃，檸檬酸調pH 3.5，酶解時間3 h。

離心分離：在5 000 r/min的條件下離心10 min，除去沉淀得到澄清冬棗汁。

成分調整：添加蔗糖調節初始糖度為16%，檸檬酸調pH 4.5。

殺菌、冷卻：105 ℃條件下殺菌20 s，冷卻至50～55 ℃。

酵母菌活化：試管裝入0.5 g蔗糖于10 mL蒸餾水中，高壓滅菌后冷卻至37 ℃左右，加入0.5 g活性干酵母粉，37 ℃水浴活化30 min。將3接種環酵母菌活化液接入滅菌的5 mL冬棗汁中，30 ℃靜置培養24 h。將培養的酵母菌液按3%的接種量接入滅菌的100 mL冬棗汁，30 ℃靜置培養24 h，備用。

醋酸菌活化：將2接種環選定的產醋酸菌株接入滅菌的5 mL冬棗汁中于30 ℃、120 r/min搖床中培養24 h。將培養的菌株按3%的接種量接入滅菌的100 mL冬棗汁，于30 ℃、120 r/min搖床中培養24 h，備用。

酒精發酵：初始糖度16%，酵母菌接種量5%，發酵溫度30 ℃，密閉靜置發酵至酒精度上升緩慢時停止。

醋酸發酵：調整初始酒精度為8%vol，醋酸菌接種量10%，裝液量為50 mL/150 mL，發酵溫度30 ℃，在50 r/min轉速下振蕩發酵14 d，以發酵液酸度上升緩慢時發酵停止。

過濾、殺菌：用硅藻土抽濾，95 ℃殺菌10 min，冷卻后得到冬棗醋。

1.3.6 酒精發酵條件優化單因素試驗

將冬棗汁的初始糖度分別調至8%、10%、12%、14%、16%、18%，分別接入0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%二級擴培酵母液，將酒精發酵溫度分別調至10 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，發酵時間為4 d，以考察不同酵母菌接種量、發酵溫度及初始糖度對冬棗汁酒精度的影響。

1.3.7 醋酸發酵條件優化單因素試驗

將冬棗汁的初始酒精度分別調至6%vol、8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol，分別接入6%、8%、10%、12%、14%、16%二級擴培醋酸菌液，將發酵溫度分別調至26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃條件下發酵14 d，以考察不同醋酸菌接種量、初始酒精度及發酵溫度對冬棗醋酸度的影響。

1.3.8 冬棗醋醋酸發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對醋酸發酵溫度（A）、初始酒精度（B）、醋酸菌接種量（C），進行3因素3水平的正交試驗，以總酸含量為評價指標，采用L9（34）正交設計，確定醋酸發酵的最佳工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 醋酸發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.9 冬棗醋品質分析

（1）感官評價：根據國標GB/T 30884—2014《蘋果醋飲料》[19]，對冬棗醋色澤（20分）、香氣（20分）、滋味（40分）、外觀（20分）方面進行感官評分，滿分100分，由10人品評取平均分，冬棗醋感官評分標準[20]見表2。

表2 冬棗醋感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of winter jujube vinegar

（2）理化指標的測定：根據國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定國家標準》對冬棗醋中總酸含量（以醋酸計）進行測定；采用重鉻酸鉀比色法測定酒精度；采用糖度計測定糖度；采用酸度計測定pH值。

（3）微生物指標的測定：根據國標GB 7101—2015《食品安全國家標準飲料》，對冬棗醋的菌落總數、大腸菌群及致病菌（指腸道致病菌）進行檢驗和測定。

2 結果與分析

2.1 醋酸菌的分離鑒定

從醋酸菌分離純化固體培養基中挑選透明圈大，細胞形態類同，且占生長優勢的單菌落80個，保留革蘭氏陰性產酸菌株12 株，按照A1～A12進行編號。各菌株的菌落形態為白色半透明狀，圓形，隆起，表面光滑，直徑2～3 mm，均有運動性，在穿刺培養基中穿刺線向四周呈云霧狀擴散。菌株A1革蘭氏染色呈陰性，細胞呈桿狀，大小（0.5～0.8）μm×（1.0～4.2）μm，成對或成鏈。

將篩選出的菌株A1～A12進行生理生化試驗鑒定，結果見表3。由表3可知，對照第九版《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統鑒定手冊》，菌株A1、A2、A6、A8、A9不產2,5-二酮基葡萄糖酸、產5-酮基葡萄糖酸且不銨鹽為唯一氮源，初步判定為木醋桿菌（Acetobacter xylinum），菌株A3、A5、A10無甘油生酮表現且不產5-酮基葡萄糖酸，初步判定為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus），菌株A4、A11以銨鹽為唯一氮源，初步判定為醋化醋桿菌（Acetobacter aceti），菌株A7、A12產2,5-二酮基葡萄糖酸且無乙醇過氧化表現，初步判定為氧化葡糖桿菌（Gluconobacter oxydans）。

表3 分離醋酸菌的生理生化試驗結果Table 3 Results of physiological and biochemical tests of isolated acetic acid bacteria

從不同種屬的菌株中選擇菌株A1、A3、A4、A7進行產酸量試驗，結果見表4。由表4可知，菌株A3產酸能力低于對照菌株，A7與對照菌株產酸能力相當，均為9 d產酸量5.62 g/mL，菌株A1、A4的產酸能力高于對照菌株，A1產酸能力最高，為9 d產酸量5.89 g/mL。因此，選擇菌株A1進行分子生物學鑒定。

表4 分離醋酸菌的產酸量比較Table 4 Comparison of acid yield of isolated acetic acid bacteria

2.2 16S rDNA測序鑒定分離菌株的結果

2.2.1 16S rDNA基因片斷提取和PCR擴增

選取醋酸產量高的菌株A1進一步用分子生物學方法進行鑒定。菌株A1 16S rDNA 擴增產物連接T載體后PCR，經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。

圖1 重組質粒的PCR鑒定結果Fig.1 Identification results of recombinant plasmid by PCR

由圖1可知，觀察到出現0.8 kbp左右的一條純的DNA條帶，表明已獲得了純的菌株A1的16S rDNA基因片斷。

2.2.3 序列分析結果

將所測核苷酸序列用NCBI的基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）軟件進行序列同源性分析。采用MegaX軟件的NJ法構建系統發育樹，結果如圖2所示。

圖2 基于16S rDNA序列菌株A1的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain A1 based on 16S rDNA sequences

由圖2可知，在核酸水平上，菌株A1的16S rDNA部分序列與A.xylinum（登記號為X75619.1）的16S rDNA在同一分支且有98%的一致性。綜合細胞形態、菌落形態及生理生化特征、16S rDNA序列同源性比較，鑒定菌株A1為木醋桿菌（Acetobacter xylinum）。

2.3 冬棗醋發酵條件優化

2.3.1 冬棗醋酒精發酵條件優化單因素試驗

酒精作為醋酸發酵的重要原料，直接影響冬棗醋的酸度，進而影響其品質，使用酵母菌可以將糖代謝為酒精，以酒精度為評價指標，考察酒精發酵中酵母菌接種量、溫度和初始糖度對冬棗醋品質的影響，結果見圖3。

由圖3a可知，酵母接種量在1%～5%范圍內，酒精度隨接種量增加而增加；酵母接種量為5%時，酒精度最大，為8.2%vol；酵母接種量＞5%之后，酒精度基本穩定不變。因此，最佳接種量為5%。

圖3 酵母菌接種量（a）、發酵溫度（b）和初始糖度（c）對冬棗醋酒精發酵的影響Fig.3 Effect of yeast inoculum (a),fermentation temperature (b) and initial sugar content (c) on alcoholic fermentation of winter jujube vinegar

細胞內溫度升高，酶反應加速，促進代謝和生長，但生物活性物質可能發生變性使細胞功能下降。由圖3b可知，發酵溫度在24～30 ℃時，隨發酵溫度的升高，酒精度也隨之上升；發酵溫度為30 ℃時，酒精度最大，為8.5%vol；發酵溫度＞30℃時，隨溫度的升高，酒精度反而下降。因為細胞內溫度升高，酶反應加速，促進代謝和生長，但生物活性物質可能發生變性使細胞功能下降。因此，選擇最佳發酵溫度為30℃。

糖是酒精發酵的重要基質原料，直接影響到酒精轉化情況，糖度高時產生的酒精度也相對較高，但過高反而抑制微生物的發酵。由圖3c可知。隨初始糖度在8%～16%范圍內的增大，酒精度隨之增加；初始糖度為16%時，酒精度為8%vol；初始糖度＞16%之后，酒精度基本穩定。因此，初步確定最適初始糖度為16%。

2.3.2 冬棗醋醋酸發酵條件優化單因素試驗

以酸度為評價指標，考察醋酸發酵中醋酸菌接種量、酒精度及發酵溫度對冬棗醋品質的影響，結果見圖4。

圖4 醋酸菌接種量（a）、初始酒精度（b）及發酵溫度（c）對冬棗醋醋酸發酵的影響Fig.4 Effect of acetic acid bacteria inoculum (a),initial alcohol content (b) and fermentation temperature (c) on acetic fermentation of winter jujube vinegar

由圖4a可知，酸度隨醋酸菌接種量在4%～10%范圍內增加而升高，接種量在10%以上酸度變化不大，這是由于發酵液內的營養物質不能高效利用。因此，選擇10%為醋酸菌最佳接種量。由圖4b可知，酸度隨初始酒精度在4%vol～8%vol范圍內提高而升高，酒精度在8%vol以上酸度變化不明顯，選擇最適初始酒精度為8%vol。由圖4c可知，發酵溫度在26～30 ℃范圍內增加，酸度隨發酵溫度升高而增加；發酵溫度在30 ℃時，酸度最大，為3.42 g/100 mL；發酵溫度＞30 ℃之后，酸度隨發酵溫度升高而降低。因此，選擇30 ℃為最佳發酵溫度。

2.3.3 冬棗醋醋酸發酵條件優化正交試驗

為了確定冬棗醋醋酸發酵的最優條件，對醋酸菌接種量（A）、發酵溫度（B）、初始酒精度（C）進行3因素3水平的L9（34）正交試驗，發酵時間為14 d，以酸度為考察指標，正交試驗優化醋酸發酵條件結果與分析見表5。

表5 醋酸發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for acetic acid fermentation conditions optimization

續表

由表5可知，3個影響因素的主次關系是：A（發酵溫度）＞B（初始酒精度）＞C（接種量）。最佳發酵條件組合為A3B2C1，即冬棗醋醋酸發酵條件為發酵溫度為32 ℃，初始酒精度為9%vol，接種量為8%，發酵時間為14 d。在此最佳醋酸發酵條件下進行3次驗證試驗，冬棗醋總酸含量（以乙酸計）為4.76 g/100 mL。

2.4 冬棗醋醋飲料品質評價

在最佳發酵條件下制備冬棗醋，成品冬棗醋的感官指標、理化指標及微生物指標測定結果見表6。由表6可知，冬棗醋飲各項品質指標均滿足相關國標要求。

表6 冬棗醋品質指標測定結果Table 6 Determination results of quality indexes of winter jujube vinegar

3 結論

本研究從民間傳統柿子醋醅中篩選出菌株A1，經菌落細胞形態觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定其為木醋桿菌（Acetobacter xylinum）。將該木醋桿菌菌株用于冬棗醋發酵飲料的研制，采用單因素及正交試驗優化冬棗醋最佳醋酸發酵條件為木醋桿菌接種量8%，發酵溫度32 ℃，初始酒精度為9%vol。在此優化醋酸發酵條件下釀造得到的冬棗醋感官評分91分，總酸含量（以醋酸計）4.76 g/100 mL，固形物含量1.5%，淡琥珀色，口味酸甜爽口，具有冬棗特有的果香，理化及微生物指標均符合國家相關標準。