一株產吲哚乙酸耐鹽促生菌的分離、鑒定及發酵條件優化

賈西貝，王琦琦，李 楊，褚貴新，孫燕飛*

（1.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832003；2.紹興文理學院 環境科學與工程系，浙江 紹興 312000）

隨著現代農業的大力發展，在農田中濫用農藥、化肥等行為頻繁出現，導致土壤質量下降、食品安全性存在隱患。與此同時，人們開始廣泛關注具有以環保、安全、作用持久等諸多優點的植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）。因此，大量的促生菌被運用到科研中，并進一步深入到對促生菌生理效應、作用機制的研究以及相關產品的開發和應用。

吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）是普遍存在于植物體內的生長調節劑，其對植物生長有顯著的影響[1]。有相關實驗表明，IAA在植物體內參與許多生理生化的調節和控制，如細胞的伸長生長、形成層細胞的分裂、維管組織的分化等[2]。此外，IAA能通過對土壤內重金屬的吸收和富集，使重金屬對植物的毒害減小，從而起到保護植物的作用[3-5]。目前研究發現多種PGPR菌株可以產生IAA，包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）等[6-8]。它們可以通過固氮、溶磷、分泌植物激素等方式，使植物的抗逆性提高，從而促進植物快速生長以及農作物產量增加[9-10]。目前，對具有分泌IAA能力的PGPR的研究已成為熱門領域，可以通過對菌株發酵條件優化或者增施PGPR菌肥來提高目標代謝產物[11-12]。張振等[13]從植物根際土壤中篩選出的耐鹽節桿菌能分泌IAA，經過一系列單因素試驗，得到了最佳發酵條件，在最優的條件下，該菌株產IAA能力可達92.31 mg/L。徐偉慧等[14]研究了不同西瓜PGPR分泌IAA的能力，其中一株菌的IAA產量高達117.3 mg/L。也有研究表明，PGPR的促生效果會受到土壤類型的影響，李哲[15]將標記菌株接種在未滅菌的土壤中，發現其存活能力較好，推測原因可能是土壤中其他生物的分泌物質對其生長產生了有利的作用。但還有一些文獻報道，很多根際促生菌在滅菌土壤中的存活能力要大于未滅菌土壤，由此可見，選擇適合本地環境的PGPR十分重要[16-17]。

本實驗室從堿蓬（Suaeda salsa）根際土壤中分離出一株產IAA菌株，利用單因素及響應面分析法對菌株進行發酵培養條件及培養基成分的優化，旨在提高IAA產量，為后續生物促生菌肥的研究奠定了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤樣品及處理

選取新疆維吾爾自治區石河子市周邊土壤鹽漬化較為嚴重的區域，采集該區域（兵團八師147團）內生長情況良好的堿蓬根際土壤，將其立即過2 mm的篩網，封裝土樣于無菌自封袋中，液氮冷凍保存。

1.1.2 化學試劑

Salkowski顯色劑：0.5 mol/L FeCl3與35%HClO4體積比按1∶50配制；吲哚乙酸（IAA）（分析純）：美國Sigma公司；L-色氨酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基（斜面培養基）：蛋白胨10.0 g/L，NaCl 50.0 g/L，牛肉膏3.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH 7.4。121 ℃滅菌20 min。

1/2MS培養基：大量元素50 mL，鈣鹽50 mL，微量元素10 mL，鐵鹽10 mL，有機溶液10 mL，瓊脂8 g，蔗糖30 g，pH值6.8，定容至1 L。121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0。121 ℃滅菌20 min。

種子培養基、基礎發酵培養基采用LB液體培養基。

1.2 儀器與設備

X3R高速冷凍離心機FroFleX聚合酶鏈式反應（poly merase chain reaction，PCR）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；RS-232精密電子天平：上海恒平科學儀器有限公司；759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；ZWY-211B搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

在裝液量為100 mL/250 mL牛肉膏蛋白胨培養基中加入5 g堿蓬根際土樣，28 ℃、180 r/min搖床富集培養1 d。對此菌液進行10-2、10-3、10-4、10-5梯度稀釋，取其稀釋液各100 μL，采用稀釋涂布平板法涂布于牛肉膏蛋白胨培養基中，28 ℃條件下培養48 h，獲得單菌落，轉接于斜面培養基后培養48 h，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 產IAA菌株的篩選及含量測定[18-19]

定性初篩：將分離純化后的菌株接種于質量濃度為100 mg/LL-色氨酸的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min條件下搖床培養24 h，取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入等量Salkowski顯色液進行顯色反應。以加入50 μL IAA（50 mg/L）的標準液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫、避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠產IAA。

吲哚乙酸標準曲線的制作：配制質量濃度分別為0、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL的IAA標準溶液，并按照1∶1體積比與Salkowski顯色劑混合，室溫避光30 min，分別在波長530 nm條件下測定其吸光度值，以蒸餾水按照1∶1體積比與Salkowski顯色劑混合液為空白對照，以IAA標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，OD530nm值（y）為縱坐標繪制IAA標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.01x-0.073 7，相關系數為R2=0.993 1。

IAA含量測定：篩選菌株接種于LB液體培養基中，37℃、200 r/min條件下搖床培養24 h后取出，4 000 r/min離心15 min，取上清液4 mL與等體積Salkowski顯色劑混合，25 ℃避光反應30 min，測定OD530nm值。根據IAA標準曲線回歸方程計算菌液中IAA含量。

1.3.3 菌株的鑒定

挑取IAA產量最高的菌株單菌落于牛肉膏蛋白胨培養液中，培養至對數期后，使用十六烷基三甲基溴化銨法（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取基因組總DNA[15]。用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTACGACTT-3'）對菌株16S rRNA基因進行PCR擴增，PCR反應體系（25 μL）：DNA模板1 μL，2×TaqPCR MasterMix 10 μL，5 μmol/L引物27F 1 μL，5 μmol/L 1492R 1 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應條件為：94 ℃、5 min；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、1 min，共30個循環；72 ℃、10 min。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，將16S rRNA基因序列上傳至美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數據庫獲得登錄號，并將其序列于NCBI中進行比對，使用MEGA 6.0，用鄰接法（neighbour joining，NJ）構建系統發育樹，進行系統發育樹分析。

1.3.4 擬南芥平板試驗

為了探究短小芽孢桿菌BG-5的促生效果，在1/2MS平板培養基中央用滅菌打孔器打直徑為1 cm的孔，將2 mL牛肉膏蛋白胨培養基注入孔內，移取表面消毒后的種子，種于距中心約2.5 cm的位置，每個平板種8粒，16 h黑暗，8 h光照，18 ℃光照培養箱培養5 d，待擬南芥發芽長出些許嫩葉后，挑取篩選得到的BG-5菌株，接種于中央的牛肉膏蛋白胨培養基上，以接種無菌水為對照組（CK）。擬南芥生長30 d后，觀察其生長情況。

1.3.5 菌株種子液的制備、發酵培養及生長曲線的測定

種子液的制備：于活化斜面挑取一環篩選得到的高產IAA的菌株BG-5接種至裝液量為30 mL/250 mL種子培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養9 h，得種子液；發酵培養：在無菌環境中，取種子液1 mL至裝液量為30 mL/250 mL發酵培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養24 h。

生長曲線的測定：取活化斜面后的菌株BG-5一環接種至裝液量為30 mL/250 mL種子培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養。每2 h取一次樣，測定發酵液在波長600 nm條件下的OD600nm值，并繪制菌株的生長曲線。

1.3.6 發酵培養基成分優化

（1）單因素試驗

碳源及其添加量的確定[20]：以5 g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、玉米粉、山梨醇、酵母提取物為碳源，碳源添加量梯度分別為3 g/L、5 g/L、7 g/L、10 g/L、15 g/L，考察不同碳源及碳源添加量對IAA含量的影響。

氮源及其添加量的確定：以10g/L的尿素、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、胰蛋白胨為氮源，氮源添加量梯度分別為5g/L、7 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，考察不同氮源及氮源添加量對IAA含量的影響。

金屬離子及其添加量的確定：以10 g/L的NaCl、CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4、MnSO4為金屬離子，篩選金屬離子含量梯度分別為5 g/L、7 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L，考察不同金屬離子及添加量對IAA含量的影響。

（2）響應面分析試驗

采用單因素試驗選取培養基成分的濃度范圍，并根據響應面分析法中的Box-Behnken試驗方案進行設計，以酵母提取物添加量（A）、胰蛋白胨添加量（B）和MgSO4·7H2O添加量（C）為自變量，以IAA產量（Y）為響應值，優化發酵培養基配方，并進行驗證。

1.3.7 搖瓶發酵條件優化

在裝液量分別為10 mL/250 mL、30 mL/250 mL、50 mL/250 mL、70 mL/250 mL、100 mL/250 mL，初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0及發酵溫度分別為24 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃條件下，優化后的發酵培養基中發酵培養，分別考察裝液量、初始pH值及發酵溫度對IAA含量的影響。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和篩選

一共篩出5株菌株進行定性初篩，并對產生IAA的菌株進行定量檢測，結果見表1。由表1可知，有2株產生IAA，結合IAA的產量測定，選取一株產IAA能力較好的菌株進行后續實驗，并根據采集地及采集部位將其編號為BG-5。

表1 菌株篩選結果Table 1 Screening results of strains

2.2 菌株的鑒定

根據16S rDNA測序與NCBI數據庫基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對的結果，對產IAA菌株BG-5與參比菌株構建系統發育樹分析結果如圖1所示，菌株BG-5與Bacillus zhangzhouensisstrain D10302（GenBank核酸登錄號為MK070088.1）的同源性高達93%，故將菌株BG-5鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），將核酸序列上傳至NCBI數據庫，其登錄號為MK016484。

圖1 菌株BG-5基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain BG-5 based on 16S rRNA gene sequences

2.3 擬南芥平板試驗

結果如圖2所示，與不接菌株的對照（左邊平皿）相比，擬南芥的葉表面積有所增加，表明短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）BG-5可以產生某種物質能夠促進擬南芥生長。

圖2 菌株BG-5對擬南芥生長的促生效果Fig.2 Growth-promoting effect of strain BG-5 on Arabidopsis thalina

2.4 菌株BG-5的生長曲線

圖3 短小芽孢桿菌BG-5的生長曲線Fig.3 Growth curve of Bacillus pumilus BG-5

對菌株BG-5進行生長曲線的繪制，結果見圖3。由圖3可知，2～6 h為菌株BG-5的延遲期，從第8小時開始該菌株進入對數生長期，其后菌體生長迅速，菌體濃度快速升高；12～18 h菌體生長速度逐漸減小至平緩。因此，選擇培養8～10 h的菌體作為種子液。

2.5 培養基組分及含量對短小芽孢桿菌BG-5產吲哚乙酸的影響

通過對不同培養基組分及含量的篩選，結果見圖4。由圖4a1可知，在培養基中不加碳源，短小芽孢桿菌BG-5的吲哚乙酸產量最少，但該菌株對于酵母提取物、玉米粉和蔗糖的利用較有效，其中酵母提取物作為碳源時產吲哚乙酸量最高，達到44.17 μg/mL。因此，選擇酵母提取物作為最佳碳源。由圖4a2可知，隨著酵母提取物添加量的增加，IAA的產量先增加后減小，當其酵母提取物添加量為7 g/L時，IAA產量達到最大，為85.37 μg/mL。因此，選擇最適酵母提取物添加量為7 g/L。

圖4 不同培養基組分及添加量對菌株BG-5產吲哚乙酸的影響Fig.4 Effect of different medium component and addition on indoleacetic acid yield by strain BG-5

由圖4b1可知，胰蛋白胨為氮源所產的IAA量最高，其IAA產量達到最高，為51.97 μg/mL。因此，選擇胰蛋白胨作為最佳碳源。由圖4b2可知，隨著胰蛋白胨添加量的增加，IAA的產量也隨之增加，當胰蛋白胨添加量為10 g/L時，IAA產量最大，達81.02 μg/mL，進一步增加胰蛋白胨添加量，IAA產量減小，原因為高濃度的胰蛋白胨導致碳氮比降低，不利于產物積累。因此，選擇胰蛋白胨最適添加量為10 g/L。

由圖4c1可知，在發酵培養基中分別添加10 g/L Mg2+、Na+、Ca2+時，IAA產量較高；其中當加入Mg2+時產IAA最高，高達64.37 μg/mL。因此，選擇Mg2+作為最佳金屬離子。由圖4c2可知，隨著七水硫酸鎂添加量的增加，IAA產量先增加后減少，當其添加量為7 g/L時，IAA產量達到最大，為65.17μg/mL。因此，選擇最適七水硫酸鎂的添加量為7 g/L。

2.6 響應面分析試驗結果

以單因素試驗為基礎，對菌株BG-5產IAA發酵培養基進行響應面分析。響應面試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3，各因素間的交互作用對短小芽孢桿菌BG-5產吲哚乙酸的影響結果見圖5。

表2 Box-Behnken試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken experiments

續表

利用Design-Expert 10.0軟件對數據進行二次多元回歸擬合，得到吲哚乙酸產量（Y）對酵母提取物添加量（A）、胰蛋白胨添加量（B）和MgSO4·7H2O添加量（C）的二次多項回歸方程為：Y=86.57-5.31A-18.13B-0.14C-4.33AB+7.06BC-17.90A2-16.86B2-14.5C2。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，回歸模型的P值為0.008 4＜0.01，表明模型對試驗結果具有極顯著的影響；而失擬項P值=0.090 7＞0.05，不顯著，說明未知因素對試驗結果的影響較小；該模型的決定系數R2=0.901 6，變異系數（coefficient of variation，CV）值較低為16.44%，由此可知回歸方程的擬合度較好，可信度高，可以用此模型對短小芽孢桿菌BG-5產IAA量進行預測。回歸方程的一次項B和二次項A2對IAA產量有極顯著影響（P＜0.01），二次項B2、C2對IAA產量有顯著的影響（P＜0.05），其他因素對IAA產量的影響不顯著（P＞0.05）。通過響應面優化得出短小芽孢桿菌BG-5產吲哚乙酸的最佳培養基配方為酵母提取物7.298 g/L、胰蛋白胨8.773 g/L、七水硫酸鎂7.151 g/L，IAA產量預測值為91.838 μg/mL。為方便實際操作，將培養基組分修改為酵母提取物7.3 g/L、胰蛋白胨8.8 g/L、七水硫酸鎂7.2 g/L，在此最優培養基組分下，得出實際IAA產量平均值為87.86 μg/mL，與預測值接近，說明模型具有很高的可靠性。

圖5 各因素間的交互作用對短小芽孢桿菌BG-5產吲哚乙酸影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on indoleacetic acid production by Bacillus pumilus BG-5

2.7 不同培養條件對短小芽孢桿菌BG-5產吲哚乙酸的影響

由圖6a可知，當裝液量為30 mL/250 mL時，BG-5菌株產生的IAA量最多，達43.64 μg/mL。進一步增加裝液量，IAA的產量逐漸減少，這可能與發酵液中的溶氧量多少有關。因此，選擇最佳裝液量為30 mL/250 mL。

由圖6b可知，BG-5菌株在初始pH值為8時生長最好，產IAA量最高，為44.02 μg/mL，可能是因為pH值會影響菌株對培養基里各種營養物質的有效吸收和利用，進而影響其細胞中的代謝酶活性，從而決定菌株的正常生長。因此，選擇最佳初始pH值為8。

由圖6c可知，發酵溫度為37 ℃時菌株產IAA量多，高達52.64 μg/mL，其次是42 ℃，菌株產IAA量為49.74 μg/mL。溫度過高或過低都會降低產IAA相關酶的活性。因此，選擇最佳發酵溫度為37 ℃。

圖6 不同培養條件對菌株BG-5產吲哚乙酸的影響Fig.6 Effects of different fermentation conditions on indoleacetic acid production by strain BG-5

3 結論

本實驗室對從新疆鹽堿地的堿蓬根際中分離獲得一株產IAA的PGPR進行了一系列優化試驗，確定其最佳培養條件為裝液量30 mL/250 mL、起始pH值為8、培養溫度37 ℃，菌株BG-5產吲哚乙酸的最佳培養基配方為酵母提取物7.3 g/L、胰蛋白胨8.8 g/L、七水硫酸鎂7.2 g/L。在最優條件下，IAA產量為87.86 μg/mL，約為優化前（39.70 μg/mL）的2倍。該試驗為功能微生物肥料的研發提供了更多選擇，也為后續菌株的開發和應用奠定基礎。