不同乳酸菌胞外分泌物抗氧化活性的研究

黃 麗，楊 攀，曾慶坤，謝美華，孫 寧，唐 艷，李 玲*

（1.中國農業科學院 廣西水牛研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；3.皇氏集團股份有限公司，廣西 南寧 530000）

生物機體正常情況下擁有完整的氧化-抗氧化平衡機制，當外界條件破壞平衡引起機體發生氧化應激，破壞機體內生物大分子和加速老化，進而引發高血壓、缺血性心臟病、關節炎、癌癥等疾病[1]。

乳酸菌被公眾認為是最安全的食品級微生物，具備抗過敏、緩解乳糖不耐癥、提高機體免疫力等生理功能[1-2]。近幾年，有專家指出氧化應激與慢性病等密切相關，乳酸菌屬于天然的抗氧化劑，通過清除活性氧和自由基、螯合金屬離子、多種氧化還原調控系統和激活抗氧化體系等途徑發揮抗氧化作用，逐漸引起研究人員的廣泛重視[3]。研究發現，乳酸菌具有明顯的抗氧化作用，能清除自由基、提高抗氧化酶活力、螯合金屬離子等[4]，且被大量體內外試驗證實其良好的抗氧化活性[5]。目前研究熱衷于檢測乳酸菌不同部位的抗氧化能力，通過測定脂質過氧化抑制能力、自由基清除能力和動物學實驗來評價抗氧化效果，其中自由基清除能力是應用較多的評價指標，包括清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基、過氧化物、超氧陰離子的能力以及過氧化氫能力[6]。黃玉軍等[7]對分離自長壽人群腸道6株乳酸菌體外抗氧化活性進行研究發現菌株發酵上清液的抗氧化活性總體要優于菌體和胞內提取物。王曦等[8]對35株乳酸菌的菌體、無細胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進行研究，抗氧化活性物質較多分布在乳酸菌胞外分泌物中。姚杰玢等[9]也同樣發現所研究的8株乳酸菌中發酵上清液對自由基的清除能力遠高于完整細胞和無細胞提取物。

本研究擬通過測定羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH 自由基的清除率以及還原能力，對不同來源（干酪、生水牛乳、酸奶、牛乳房邊緣）的28株乳酸菌胞外分泌物的體外抗氧化能力進行檢測，并分析不同檢測方法的相關性，評價不同乳酸菌抗氧化能力，為后期開發乳酸菌抗氧化制劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗中所用的28 株乳酸菌均保存在廣西水牛研究所，其詳細信息見表1。

表1 實驗所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 化學試劑

鐵氰化鉀（分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、三氯化鐵、無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；三氯乙酸、30%過氧化氫（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；DPPH（分析純）：美國Sigma公司；維生素C（vitamin C，VC）（分析純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基：青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-8000紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；SHP-150生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；PB-10 pH計：德國賽多利斯集團；SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；YM 50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機、LP Vortex Mixer旋渦振蕩器：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的培養及胞外分泌物的制備

分別取28株乳酸菌凍存菌液100 μL于6 mL MRS肉湯培養基中，37 ℃靜置培養24 h，活化菌株。活化后按2%接種量接種于MRS肉湯培養基，37 ℃靜置培養24 h，收集發酵液，用超純水將乳酸菌的菌數調整至108CFU/mL，經8 000 r/min條件下4 ℃離心30 min，收集發酵上清液，即為乳酸菌胞外分泌物，用0.45 μm的濾膜過濾，放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.3.2 乳酸菌胞外分泌物的抗氧化活性

為了更直觀表明樣品的抗氧化能力，選用VC作為陽性對照，將樣品抗氧化能力轉化為同一清除率數值下對應的VC濃度范圍，以VC當量進行對照評價。

（1）DPPH自由基的清除能力測定

參照文獻[12]所述方法進行測定，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為1.5 mL蒸餾水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液的吸光度值；A1為1.5 mL樣品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的無水乙醇溶液的吸光度值；A2為1.5 mL樣品液加1.5 mL無水乙醇溶液的吸光度值。

（2）羥自由基的清除能力測定

參照文獻[13]所述方法并略有修改，羥基自由基清除率計算公式如下：

（3）超氧陰離子自由基的清除能力測定

參考文獻[10]所述方法，略有改進，超氧陰離子清除率計算公式如下：

式中：ΔA0為對照組的吸光度值做出曲線的斜率；ΔA1為樣品的吸光度值做出曲線的斜率。

（4）還原能力測定

按照參考文獻[14]所述方法，以蒸餾水代替FeCl3溶液作為空白調零，于波長700 nm 處測定吸光度值。以吸光度值反映樣品的還原能力，吸光度值越大，說明還原能力及抗氧化性越強。

1.3.3 統計分析

采用SPSS20.0統計軟件處理實驗數據，采用Duncan進行單因素方差分析，采用Pearson進行相關性分析。每個實驗進行2次重復，結果以平均值±標準差（X+SD）表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對DPPH自由基清除能力的比較

DPPH 自由基一種以氮為中心穩定性很好的大分子，與具有抗氧化活性的物質反應后在波長517 nm 處吸收峰減弱，以此變化來評價抗氧化能力，DPPH清除率越大表明抗氧化能力越強，是一種常用于評價抗氧化效果的有效方法[8]。本研究在反應體系中加入28株乳酸菌胞外分泌物，測定其對DPPH自由基的清除效果從而確定其抗氧化性能，結果見表2。

表2 28株乳酸菌的胞外分泌物對DPPH自由基的清除率Table 2 DPPH free radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

由表2可知，28株菌株都表現出一定的DPPH自由基清除能力，清除能力較強且差異較大，清除率為29.80%～74.90%，為0.004～0.010 mg/mL VC當量。其中乳酸菌WC5、ZC1、WM7、GC2、RY1、ZC2、WC1、WC4具有較強的清除能力，均在66%以上，為0.008 mg/mL 以上的VC當量，與其余乳酸菌的DPPH自由基清除能力差異顯著（P＜0.05）。同時，研究也發現在菌株在種內和來源也存在著一定的差異。其中菌株ZC1、ZC2、ZM3、ZB4都屬于植物乳桿菌，但存在顯著的種內差距（P＜0.05）；6株WC都是來源于干酪的戊糖乳桿菌，但WC1、WC4、WC5的DPPH自由基清除率顯著高于WC2、WC3、WC6（P＜0.05），表現出相同來源的種內差距；菌株RY1、RB2、RM3為不同來源的乳酸乳球菌，DPPH自由基清除率有顯著性差異（P＜0.05），表現出不同來源的種內差距。本研究結果與其他學者[15-16]的研究結果一致，這種差異可能是由不同來源的菌株DPPH自由基的活性物質的含量或種類不同造成的。

2.2 乳酸菌對羥自由基清除能力的比較

生命體代謝過程中在線粒體內產生自由基并釋放到細胞質中，其中羥自由基的氧化性極強，與生物大分子發生鏈式反應造成細胞損傷，乳酸菌細胞內存在螯合Cu2+和Fe2+的天然物質，在此反應之前將自由基清除，從根本上減少羥自由基，測定乳酸菌對羥自由基的清除率能反應其抗氧化效果，羥自由基的清除率越高，表明抗氧化能力越強[17-18]。本實驗對28株乳酸菌胞外分泌物的羥自由基清除能力進行了研究，結果見表3。

表3 28株乳酸菌的胞外分泌物對羥自由基的清除率Table 3 Hydroxyl free radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

由表3可知，所有菌株都表現出一定的羥自由基清除能力，清除率在10.97%～58.67%，為0.04～0.2 mg/mL VC當量。其中菌株GC2、ZC1、WM7、RY1、WM8表現出較強的羥自由基清除能力，達到54%以上，為0.1～0.2 mg/mL VC當量，顯著高于其他菌株（P＜0.05），遠高于王曦等[6]研究的35株乳酸菌胞外分泌物的羥自由基清除能力，而ZB4表現出最低的還羥自由基清除能力，僅為10.97%，為0.04 mg/mL VC當量。可能是不同乳酸菌所含的清除羥自由基活性物質成分或含量不同造成。另外，菌株在種內和種間也存在著一定的差異，德氏乳桿菌DF1和DY2之間的羥自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），表現出種內差異；不同種植物乳桿菌ZC1、ZC2、ZM3、ZB4和德氏乳桿菌DF1、DY2之間的羥自由基清除能力差異顯著（P＜0.05），表現出種間差異，這可能是不同乳酸菌所含活性物質不同所決定的。

2.3 乳酸菌對超氧陰離子自由基清除能力的比較

超氧陰離子是氧氣在需氧生物體內生成的第一種自由基，可以在金屬離子的催化作用下發生反應產生活性較高的羥自由基，會對植物組織有損害作用，是抗氧化性能的重要指標。有學者[19]研究發現，人體在攝入某些乳酸菌后，能有效降低活性氧、超氧陰離子和過氧化氫的濃度。本實驗對28株乳酸菌胞外分泌物的超氧陰離子自由基清除能力進行了研究，結果見表4。

表4 28株乳酸菌的胞外分泌物對超氧陰離子自由基的清除率Table 4 Superoxide anion radical scavenging rate of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

由表4可知，28株乳酸菌的胞外分泌物均具有較強的超氧陰離子自由基清除能力，其清除率在70.83%～98.26%之間。其中有5株乳酸菌GB8、GY7、DY2、GC2、RY1胞外分泌物的清除率＞87%，為0.08～0.30 mg/mL VC當量，并且與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。同時檢測出GY3的清除能力最弱，但其清除率也＞70.83%，為0.06～0.07 mg/mL VC當量。研究表明，乳酸菌清除超氧陰離子的活性物質大部分存在于細胞外，存在于乳酸菌的代謝分泌物中，本研究的乳酸菌的胞外分泌物清除率高于其他學者研究中的其他部位。姚杰玢等[9]對8株乳酸菌的超氧陰離子清除能力進行測定，發現菌株R36的發酵上清液、完整細胞菌懸液和無細胞提取物清除率最高，其中發酵上清液72.02%為三者最高，但遠低于本實驗中大部分乳酸菌胞外分泌物的超氧陰離子清除率。

2.4 乳酸菌對還原能力的比較

還原能力是指還原酶和非酶復合物抵抗氧脅迫和降低螯合亞鐵離子的能力，是體外評價抗氧化活性的關鍵指標，通過使Fe3+（鐵氰化鉀）生成Fe2+（亞鐵氰化鉀），Fe2+再和FeCl3反應生成布魯士藍色化合物，測定波長700 nm 處最大吸光值來反應還原能力大小，其抗氧化能力，A700nm值越大，其還原能力越大，抗氧化作用也越大[1，15，21]。由表5可知，28株乳酸菌胞外分泌物均具有一定的還原能力，A700nm值的范圍在0.578～0.964，為0.1～0.2 mg/mL VC當量，其中菌株GB8、FB1、RY1、WM8、GY7、RM3、GC2、ZC1 表現出較強的還原能力，均達到0.820以上，顯著高于其他菌株（P＜0.05），而菌株FM3的還原能力最低，A700nm為0.578，為0.08 mg/mL VC當量。除了戊糖乳桿菌和干酪乳桿菌之外，其余4個種屬均表現出顯著種內差異（P＜0.05）；植物乳桿菌ZC1、ZC2、ZM3、ZB4與發酵乳桿菌FB1、FB2、FM3又存在顯著種間差異（P＜0.05）。這個結果與[16]研究一致，該研究指出17株乳酸菌的無細胞提取物的還原能力存在種內和種間差異。由此可推斷，乳酸菌具還原能力的活性物質也存在代謝分泌物中，但不同屬或同屬不同菌株的乳酸菌胞外分泌物具有還原能力的活性物質存含量不同。

表5 28株乳酸菌的胞外分泌物的還原能力Table 5 Reducing capacity of extracellular secretions of 28 lactic acid bacteria

2.5 不同抗氧化活性測定方法間的相關性

體外評價方法屬于化學方法，是在體外模擬氧化反應過程，通過測定不同生理狀態乳酸菌的還原能力、清除自由基能力等指標，評價其抵抗氧脅迫的能力。由于各種評價指標方法的測定機理不同，單一的化學方法來篩選高抗氧化活性的乳酸菌菌株有一定局限性，因此對所用到方法進行相關性分析，評價其相關性。4種不同的方法測定結果表明，本研究中的不同乳酸菌胞外分泌物均有一定的抗氧化能力，其中菌株GC2在4種方法中均名列前7以上，表現出最強的綜合抗氧化能力，菌株ZB4在4種分析方法中均為倒數第四以后，表現出最弱的綜合抗氧化能力。本研究通過比較4種體外抗氧化活性分析方法的相關性，結果見表6。

表6 抗氧化活性分析方法間相關性Table 6 Correlation between different analytical methods of antioxidant activity

由表6可知，羥自由基與DPPH自由基（R=0.633）、超氧陰離子自由基與還原能力（R=0.488）方法間極顯著相關（P＜0.01）；羥自由基與還原能力（R=0.295）方法間顯著相關（P＜0.05）。而DPPH自由基與超氧陰離子、還原能力，羥自由基與超氧陰離子自由基方法間沒有顯著的相關性（P＞0.05）。這與謝麗源[14]的研究結果是一致的。結果表明，化學方法的測定機理不同，而乳酸菌抗氧化作用模式多樣，單一方法不具有代表性，應盡量選擇幾種評價抗氧化的方法。

3 結論

本研究主要對28株乳酸菌胞外分泌物的3種自由基清除率及還原能力進行測定，來源于牛乳房邊緣的副干酪乳桿菌GB8 的胞外分泌物對超氧陰離子自由基清除率最高，為98.26%，為0.10～0.30 mg/mL VC當量；還原能力也最強，A700nm值為0.964，為0.1～0.2 mg/mL VC當量。從干酪分離的戊糖乳桿菌WC5對DPPH自由基的清除率最高，為74.90%，為0.01 mg/mL VC當量。干酪乳桿菌GC2對羥自由基清除率最高為58.67%，為0.1～0.2 mg/mL VC當量，其對DPPH的清除率為73.09%，對超氧陰離子自由基清除率為87.50%，還原能力的A700nm值為0.806，表現出最強的綜合抗氧化能力。由此，篩選得到GB8、WC5和GC2三株抗氧化能力相對較強的乳酸菌菌株，可用于抗氧化劑的進一步開發應用。同時對不同測定方法間的相關性進行研究，羥自由基與DPPH自由基（R=0.633）、超氧陰離子自由基與還原能力（R=0.488）；羥自由基與還原能力（R=0.295）這幾種方法的相關性較高，不同的體外評價抗氧化能力方法所得結果間具有不同的統計學相關性。在本研究的基礎上，將篩選出的有效菌株GB8、WC5和GC2進一步做體內抗氧化模型，分析乳酸菌抗氧化的物質成分，分離抗氧化活性物質，并對目前尚不太清除的乳酸菌抗氧化作用機制作深入研究。