刺楸樹皮中總皂苷的提取工藝優化及其抑菌活性

張曉紅，楊瑞琪，向 福，2 *，薛 松，彭 爽

（1.黃岡師范學院 經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

刺楸（Kalopanax septemlobu）是五加科（Araliaceae）刺楸屬（Kalopanax）落葉、闊葉喬木，分布廣泛，主要生長在中國的東北、華北、華中、華南和西南地區，以及國外的朝鮮、蘇聯西伯利亞地區和日本[1]。刺楸具有很高的藥用價值，其根莖皮和葉均可入藥，用于治療神經痛、風濕骨痛及跌打損傷等[2-3]。現代研究表明，刺楸中的皂苷成分具有明顯的抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗類風濕[6]、抗氧化[7]、抗糖尿病[8]等藥理活性。

皂苷分布在刺楸不同組織部位。BULGAKOV V P等[9]研究發現，刺楸不同組織中皂苷的含量從高到底依次為根、莖皮、綠葉、落葉和鋸末，而程東巖等[10]研究吉林集安刺楸發現，葉中的總皂苷含量較樹皮高，且有研究發現刺楸莖皮中分離出的化合物能抑制皮膚真菌[11]。

目前關于藥用植物中提取皂苷的方法主要有酶法提取[7]、微波提取[12]、超聲提取[13]、超臨界流體萃取[14]等新型方法，但這些方法在一定程度上存在設備投資較大、生產成本較高、安全性、生產條件較高等問題[15]，因此實際生產中仍是主要利用乙醇溶液進行滲漉、浸漬、回流等方法提取[16]。

鄂東大別山的野生刺楸資源十分豐富，當地居民經常將其莖皮熬成汁用于皮膚病防治。為了科學利用本地刺楸的莖皮資源，本實驗擬以刺楸樹皮為材料，采用單因素及響應面試驗探討其乙醇加熱回流法的最佳提取工藝條件，并通過抑菌圈法評價刺楸樹皮提取物的抑菌活性，從而為刺楸莖皮的利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

刺楸樹皮：采自大別山國家森林公園；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、酵母菌：本實驗室提供。

1.1.2 化學試劑

高氯酸（分析純）：天津市鑫源化工有限公司；香蘭素、冰乙酸、葡萄糖、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、甲醇（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；人參皂苷Re標準品（純度＞98%）（批號20161218）：上海金穗生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

LB液體培養基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨6 g/L，NaCl 6 g/L，用2 mol/L的NaOH調pH值為7.2，蒸餾水定容至600 mL，于121 ℃滅菌20 min。LB固體培養基加入2%的瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養基：稱取100 g去皮土豆，切碎，加水500 mL，放入鍋中煮沸20 min，用4層紗布趁熱在量杯上過濾，丟棄濾渣，濾液補充水分至500 mL，加入10 g葡萄糖，于115 ℃滅菌30 min。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基為PDB培養基中加入2%的瓊脂。

1.2 儀器與設備

Cary-100紫外可見分光光度計：美國Varian公司；FA2104電子分析天平：上海精細天平有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠；HYG-B全溫度搖瓶柜：大倉市實驗設備廠；GPN型隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Re標準品0.002 3 g于10 mL容量瓶中，用甲醇將其定容至刻度，搖晃均勻，得到對照品溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備

稱取5 g刺楸樹皮粉末于500 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶15（g∶mL）加入體積分數為70%的乙醇，在60 ℃水浴鍋中加熱回流提取1.5 h，得到樣品溶液。

1.3.3 人參皂苷Re標準曲線的制作

根據參考文獻[17]，以人參皂苷Re的質量濃度（C）為橫坐標，吸光度值（A）為縱坐標，擬合標準曲線回歸方程為：A=5.012 1C+0.007 7，R2=0.999 1，表明人參皂苷Re取樣質量濃度在0.023～0.207 mg/L范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。刺楸樹皮中總皂苷得率計算公式如下：

式中：Y為總皂苷得率，%；C為樣品中總皂苷質量，mg；N為稀釋倍數；m為刺楸樹皮粉末的質量，g。

1.3.4 總皂苷提取工藝優化單因素試驗

分別稱取5 g刺楸樹皮粉末于500 mL圓底燒瓶中進行加熱回流提取單因素試驗，考察提取溫度（50℃、60℃、70℃、80 ℃、90 ℃）、提取時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、乙醇體積分數（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）（g∶mL）對刺楸中總皂苷的得率的影響。

1.3.5 總皂苷提取工藝優化響應面試驗

基于單因素，找出對總皂苷得率影響最顯著的三個因素提取溫度（X1）、提取時間（X2）和乙醇體積分數（X3）為自變量，用-1、0、1編碼每一個變量的低、中、高試驗水平，以總皂苷得率（Y）為響應值，利用Box-Behnken方法設計響應面優化試驗，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.6 抑菌活性研究

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及酵母菌4種菌為指示菌，將活化后的細菌菌種接種至LB液體培養基中，置于37 ℃的搖床中培養18 h，將活化后的酵母菌菌種接種至PDB培養基中后置于30 ℃的搖床中培養18 h。用移液槍分別移取200 μL濃度為10×106CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌懸液于LB固體培養基中，移取200 μL濃度為10×106CFU/mL的酵母菌菌液于PDA培養基中，涂布棒涂抹均勻后用打孔器打孔，再用移液槍吸取100 μL質量濃度為1.0 mg/mL總皂苷提取液于孔中，放恒溫培養箱中培養24 h，測定抑菌圈直徑[18]。

2 結果與分析

2.1 總皂苷提取工藝優化單因素試驗

2.1.1 料液比對總皂苷得率的影響

圖1 料液比對總皂苷得率的影響Fig.1 Effect of material to liquid ratio on the yield of total saponins

料液比對總皂苷得率的影響見圖1。由圖1可知，當料液比在1∶5～1∶15（g∶mL）范圍內時，刺楸樹皮中總皂苷的得率隨之升高，當料液比為1∶15（g∶mL）時，此時總皂苷的得率達到最大，為3.12%，當料液比繼續增加，總皂苷的得率則開始下降。可能的原因是隨著料液比的減小提取溶劑與物料的接觸更加充分，使得提取出的皂苷含量增加直到最大，繼續降低料液比皂苷含量不發生改變，但由于提取出其他雜質類物質，影響了皂苷含量的測定，使之變小[19]。因此，最適料液比為1∶15（g∶mL）。

2.1.2 提取溫度對總皂苷得率的影響

提取溫度對總皂苷得率的影響結果見圖2。由圖2可知，當提取溫度從50 ℃升至60 ℃時樹皮總皂苷的得率呈下降趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。當繼續升高溫度至70 ℃時，得率快速升高達到最大值為3.71%，繼續升高溫度時得率又開始下降。可能的原因是隨著溫度的不斷升高刺楸樹皮中皂苷苷鍵被高溫破壞后分解，所以呈現逐漸下降趨勢[20]。因此，最適提取溫度為70 ℃。

圖2 提取溫度對總皂苷得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield total saponins

2.1.3 提取時間對總皂苷得率的影響

圖3 提取時間對總皂苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of total saponins

提取時間對總皂苷得率的影響結果見圖3。由圖3可知，隨著提取時間在1.0～3.0 h范圍內的延長，總皂苷的得率呈先上升后下降的趨勢，當提取時間逐漸延長時，刺楸中總皂苷的得率在逐漸升高，當提取時間為1.5 h時，得率達到最大值為4.22%，繼續增加提取時間總皂苷得率反而逐漸降低，其原因可能是在提取液中，當植物材料細胞內外活性成分含量未達到平衡時，其得率隨提取時間的延長而增加，當細胞內外濃度達到平衡后，活性成分不再溶出[21]。而加熱時間過長會導致皂苷成分的降解，破壞了皂苷的活性，使總皂苷得率降低[22]。因此，最適提取時間為1.5 h。

2.1.4 乙醇體積分數對總皂苷得率的影響

乙醇體積分數對總皂苷得率的影響結果如圖4所示。隨著乙醇體積分數在50%～90%范圍內逐漸升高，總皂苷的得率先升高然后下降，當乙醇體積分數在50%～70%時，總皂苷得率逐漸升高然后達到最大值為3.49%，當乙醇體積分數＞70%時，總皂苷得率隨著乙醇體積分數的升高又逐漸降低。可能是因為乙醇體積分數低時一些親水性物質被提取出影響了皂苷的含量，乙醇體積分數太大時易形成較大滲透壓[23-24]，導致皂苷溶解性差，從而使刺楸樹皮總皂苷的得率降低。因此，最適乙醇體積分數為70%。

圖4 乙醇體積分數對總皂苷得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total saponins

2.2 總皂苷提取工藝優化響應面試驗

選取單因素試驗中對刺楸樹皮中總皂苷得率有顯著影響的3個因素：提取溫度（X1）、提取時間（X2）、乙醇體積分數（X3），固定料液比為1∶15（g∶mL），以總皂苷得率（Y）為響應值，利用Box-Behnken法響應面進行優化試驗。響應面試驗設計方案及結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

通過Design Expert 8.06軟件對表2數據進回歸方程擬合，得到各試驗因子對響應值影響的多元二次回歸方程為：Y=3.27-0.092X1-0.019X2-0.042X3-0.044X1X2-0.022X1X3-0.036X2X3-0.59X12-0.33X22-0.59X32

由表3可知，模型的P＜0.000 1，說明回歸模型效果極顯著，而模型失擬項P=0.787 0＞0.05，說明失擬項不顯著，表明該模型的擬合度好，擬合方程顯著。校正擬合度0.961 3與預測擬合度0.921 7基本一致，信噪比為17.868＞4，表明該模型可用于預測。變異系數（coefficient of variation，CV）為3.83%，決定系數R2為98.31%，表明該模型的回歸方程有很強的線性關系。因此，該回歸方程可以很好地反映刺楸樹皮總皂苷得率與提取因素之間的真實關系，即可通過該方程確定最優提取工藝條件。各因素對刺楸樹皮中總皂苷得率的影響大小為：提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間，一次項X1、二次項X22對總皂苷得率有顯著影響（P＜0.05），X12、X32對總皂苷得率有極其顯著影響（P＜0.01），其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

二元回歸多項式的響應面結果見圖5。由圖5可知，提取時間與提取溫度的等高線相交成圓形，表明提取溫度與提取時間的交互作用不明顯，乙醇體積分數與提取溫度、提取時間等高線相交的中心區域圖形據均程橢圓形，表明乙醇體積分數和提取溫度、提取時間的交互作用明顯。此外，提取時間、提取溫度、乙醇體積分數這三個因素與總皂苷提取率的響應面均構成開口向下的凸面，表明在試驗點連續區域內存在最大值。用Design Expert 8.0.6軟件自動求解總皂苷最佳提取工藝為提取溫度69.25 ℃、提取時間1.49 h、乙醇體積分數69.66%，總皂苷得率理論預測值為3.28%。

圖5 提取時間、提取溫度、乙醇體積分數交互作用對總皂苷得率影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between extraction time,temperature and ethanol volume fraction on total saponins yield

2.3 響應面驗證試驗

為方便實際操作，驗證操作中修正最佳工藝條件預測值為提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h、乙醇體積分數70%，料液比1∶15（g∶mL）。在此優化條件下，進行3次重復驗證，實測總皂苷平均得率為（3.33±0.04）%，與理論預測值3.28%基本吻合一致，表明擬合的二元多項式模型對刺楸樹皮中總皂苷的乙醇加熱回流提取工藝具有指導和預測作用。

2.4 抑菌活性結果

抑菌活性實驗結果見表4。由表4可知，刺楸樹皮總皂苷對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的抑菌圈直徑大小分別為3.00 cm、3.02 cm、2.30 cm、1.20 cm，表明1.0 mg/mL的刺楸樹皮總皂苷對細菌及真菌均有一定的抑制作用，且相比革蘭氏陰性菌，對革蘭氏陽性菌的抑制作用更強。同時由表可知，1.0 mg/mL的刺楸樹皮總皂苷提取物對細菌的抑制作用大于真菌。KIM D W等[11]發現，單糖鏈刺楸皂苷A和I（13）能有效抑制白色念珠菌（Candida albicans）KCTC 1940和新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）KCTC 7224這兩種真菌的生長，LEE M W等[25]也發現，刺楸皂苷對犬小孢菌（Microsporum canis）、球孢子菌屬真菌（Coccidioidesimmitis）、須發癬菌（Trichophytonmentagrophytes）、新型隱球菌和白色念珠菌均具有抑制作用。因此，刺楸樹皮總皂苷提取物對真菌具有一定的抑制作用，且在相同質量濃度下對細菌的抑制作用更強。

表4 刺楸樹皮總皂苷的抑菌作用Table 4 Antimicrobial effect of saponin from Kalopanax septemlobu bark

3 結論

選用乙醇回流法提取刺楸樹皮中總皂苷，基于單因素試驗并結合響應面分析軟件對刺楸樹皮中總皂苷的提取工藝進行優化，得出的最佳提取條件為提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h、乙醇體積分數70%，料液比1∶15（g∶mL）。在此優化提取條件下，總皂苷提率為3.33%。所得的乙醇提取液抑菌實驗得出，刺楸樹皮皂苷對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌的抑菌圈分別為3.00 cm、3.02 cm、2.30 cm、1.20 cm，表明刺楸樹皮皂苷對以上四種菌均有抑制作用，且在此質量濃度時對細菌的抑制效果較明顯，從而為刺楸莖皮的利用提供理論依據。