植物乳桿菌對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

張華東，韓 經，魏曉慶，劉 琳，郭學武，肖冬光*

（1.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.棗莊學院 生命科學學院，山東 棗莊 277160）

白酒是世界六大蒸餾酒之一，其獨特的釀造方式造就了白酒不同的風格與特征，其顯著特點是固態純糧混菌發酵[1]。在白酒生產過程中，釀酒微生物主要包括霉菌、酵母菌、細菌三大類[2]。其中乳酸菌貫穿白酒生產的始終，是白酒生產中一類十分重要的微生物，乳酸菌可以促進發酵過程中的美拉德反應[3]，有研究發現乳酸菌對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生長有抑制作用[4-7]，但是乳酸菌可以促進釀酒酵母風味物質的代謝[8-9]。乳酸菌產生的乳酸能使白酒的刺激性氣味減少，增加白酒的風味[10]，而且乳酸可以與乙醇酯化形成乳酸乙酯，乳酸乙酯是各種白酒中十分重要的香味物質。無論是在制曲還是發酵過程中，都可以檢測到乳酸菌，乳酸菌中又以乳桿菌居多[11-12]，這和乳桿菌對高溫、高酒精度和酸度的良好耐性有關系[13-14]。

我國白酒的生產需要依靠酒曲及環境中多種微生物的共同作用，其中酵母菌在發酵過程中起主導作用[15]。酵母菌分為釀酒酵母和非釀酒酵母，在白酒生產過程中，釀酒酵母是負責酒精發酵的主體菌，非釀酒酵母雖然酒精發酵能力不如釀酒酵母[16]，但大多數能夠高產乙酸酯類。酵母代謝產生的乙酸乙酯是很多香型白酒的主體香味物質，乙酸異戊醇和乙酸異丁酯具有水果的芳香。而高級醇是酵母酒精發酵的副產物，常見的高級醇主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、苯乙醇，白酒中適量的高級醇能使酒體豐滿協調，給人柔和的香氣，高級醇含量較低時就會導致酒中香氣較淡而且酒體顯得單薄；當高級醇含量過高時，會導致酒體中有不愉快的異雜味，并且更容易使人“上頭”[17]。

白酒生產是微生物相互作用的結果，研究微生物相互作用對白酒釀造技術的進步有著重要的意義[18]。實驗室前期通過分子生物學手段構建了一株高產酯釀酒酵母MY-15，能夠高產乙酸酯類，且酒精發酵能力與普通釀酒酵母相當。將高產酯釀酒酵母與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）在高粱汁中混合發酵，采用同步接種的方法，研究植物乳桿菌對高產酯釀酒酵母酯醇代謝的影響，為白酒生產中高產酯釀酒酵母的實際應用提供理論依據，探明高產酯釀酒酵母與植物乳桿菌協同發酵的代謝機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和原料

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：本實驗室從老白干酒醅中分離獲得；高產酯釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）MY-15（CGMCC No.5635）：天津市工業微生物重點實驗室保存。玉米粉：市售；澳洲高粱：北京紅星二鍋頭有限公司。

1.1.2 化學試劑

硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；牛肉膏、酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；一水葡萄糖（分析純）：天津光復精細化工有限公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活1×105U/mL）、糖化酶（酶活2.9×105U/mL）、酸性蛋白酶（酶活5×104U/mL）：諾維信（中國）生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

釀酒酵母種子培養基（玉米水解液）：玉米粉與水按照料液比1∶4（g∶mL）混合，添加耐高溫α-淀粉酶（10 U/g原料）90 ℃水浴作用1 h，然后繼續加熱煮沸30 min，之后補水至原體積，立即降溫到60 ℃，添加糖化酶（250 U/g原料）在60 ℃水浴作用4 h，然后用4層紗布過濾，調節糖度為12°Bx，添加硫酸銨6 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，115 ℃高溫滅菌20 min，備用。

釀酒酵母發酵培養基：高粱粉與水按照料水比1∶3（g∶mL）混合，液化糖化步驟同玉米粉水解液，糖化完成后降溫到40 ℃，添加酸性蛋白酶（30 U/g原料），水浴作用4 h，然后用4層紗布過濾，得澄清高粱汁，調節到所需糖度，115℃高溫滅菌20 min，備用。

乳酸菌種子培養基：MRS培養基[19]。

乳酸菌發酵培養基：葡萄糖質量分數為4%的MRS培養基。

1.2 儀器與設備

MS204S電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；1200系列高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋：天津市中環實驗器材有限公司；H1650-W型高速冷凍離心機：湖南湘儀科技有限公司；BX43型生物顯微鏡：日本OLYMPUS會社。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌的培養

植物乳桿菌的活化：取一環保藏于斜面上的植物乳桿菌接種于裝有5 mL MRS液體培養基的試管中，30 ℃條件下靜置培養24 h。

植物乳桿菌種子液的制備：將活化植物乳桿菌培養液轉接于裝液量為100 mL/250 mL MRS液體培養基中，30 ℃條件下靜置培養24 h。

將植物乳桿菌種子液按10%（V/V）的接種量轉接于裝有葡萄糖質量分數為4%的MRS培養基三角瓶中，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下靜置培養3 d，得植物乳桿菌發酵液。

1.3.2 高產酯釀酒酵母種子液的培養

高產酯釀酒酵母的活化：取一環保藏于斜面上的高產酯釀酒酵母接種于裝有5 mL玉米水解液的試管中，30 ℃條件下靜置培養24 h。

高產酯釀酒酵母種子液的制備：將活化好的釀酒酵母培養液轉接于裝液量為100 mL/250 mL玉米水解液中，30 ℃條件下靜置培養16 h。

1.3.3 植物乳桿菌菌懸液對釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

取植物乳桿菌二級種子培養液150mL，于4℃、7000r/min條件下離心5 min，棄上清液，向沉淀中加入16°Bx高粱汁至總體積150 mL，振蕩混勻，制成植物乳桿菌菌懸液。然后將植物乳桿菌菌懸液按照4.0%、8.0%、12.0%、16.0%的接種量接種到裝有高粱汁培養基的三角瓶中，高產酯釀酒酵母種子液接種量均為8.0%，裝液量為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發酵72 h。

1.3.4 植物乳桿菌種子培養液對釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

將培養好植物乳桿菌種子液按照4.0%、8.0%、12.0%、16.0%的接種量接種到裝有高粱汁培養基的三角瓶中，高產酯釀酒酵母種子液接種量均為8.0%，裝液量為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發酵72 h。

1.3.5 不同乳酸質量濃度對釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

取培養好的植物乳桿菌發酵液300 mL，4 ℃、7 000 r/min離心5 min取上清液，用上清液配制成不同乳酸含量的高粱汁發酵培養基（見表1），高產酯釀酒酵母種子液接種量均為8.0%，裝液量為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發酵72 h。

表1 含有不同乳酸含量的高粱汁發酵培養基配方Table 1 Formula of sorghum juice fermentation medium with different lactic acid contents

1.3.6 分析方法

乳酸檢測：采用高效液相色譜法。其色譜條件如下：HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），紫外（ultra violet，UV）檢測器，流動相為5 mmol/L的稀硫酸溶液，柱溫60 ℃，流速為0.6 mL/min，檢測波長210 nm，檢測時間23 min，進樣量20 μL。

高級醇、乙酸酯檢測：采用氣相色譜法。其色譜條件如下：氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID），載氣為高純氮氣（N2），LZP930白酒分析專用毛細管柱（50 m×0.32 mm×0.25 μm），進樣量1 μL，分流比10∶1，進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度230 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量300 mL/min，柱流量0.8 mL/min。程序升溫，50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min速率升溫至200 ℃保持5 min。

殘糖量的測定：菲林試劑法[20]；酵母菌數：血球計數板法[21-22]。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌菌懸液對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

植物乳桿菌菌懸液對高產酯釀酒酵母MY-15生長和酒精發酵的影響結果見表2。由表2可知，不同植物乳桿菌菌懸液添加量對高產酯釀酒酵母發酵過程的酵母細胞數、最終乙醇產量和發酵殘糖量沒有明顯差異，乙醇含量在73.77～74.20 g/L，殘糖量在4.01～4.21 g/L，說明植物乳桿菌對高產酯釀酒酵母的生長及酒精發酵沒有直接影響。

表2 不同植物乳桿菌菌懸液添加量對高產酯釀酒酵母生長和酒精發酵的影響Table 2 Effects of different suspension addition of Lactobacillus plantarum on the growth of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae and alcoholic fermentation

植物乳桿菌菌懸液對高產酯釀酒酵母MY-15主要風味物質的影響結果見圖1。由圖1可知，植物乳桿菌菌懸液對高產酯釀酒酵母MY-15酯代謝有一定影響，與對照（植物乳桿菌菌懸液接種量為0時）相比，植物乳桿菌菌懸液接種量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%，乙酸乙酯分別減少了4.45%、15.83%、12.94%、15.31%；乙酸異戊酯分別減少了10.12%、17.74%、8.41%、15.54%；植物乳桿菌菌懸液各接種量下乙酸異丁酯的影響不明顯，乙酸異丁酯含量在11.32～12.11 mg/L。可能原因與其含量相對較低有關。植物乳桿菌菌懸液對高產酯釀酒酵母MY-15高級醇代謝的影響各有不同，這與各高級醇不同的代謝途徑有關。其中對苯乙醇和活性戊醇的影響最為明顯，與對照（植物乳桿菌菌懸液接種量為0時）相比，植物乳桿菌菌懸液接種量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%時，苯乙醇含量分別下降了34.58%、36.78%、39.45%、42.17%，活性戊醇含量分別下降了21.58%、23.52%、26.97%、34.83%；對正丙醇和異丁醇含量的影響相對較低，植物乳桿菌菌懸液接種量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%時，正丙醇分別下降了14.89%、21.77%、17.16%、14.76%，異丁醇分別下降了9.34%、14.55%、19.52%、17.15%；各添加量對異戊醇的影響不明顯。

圖1 不同植物乳桿菌菌懸液添加量對高產酯釀酒酵母主要風味物質的影響Fig.1 Effects of different suspension addition of Lactobacillus plantarum on major flavor substances of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae

2.2 植物乳桿菌種子液對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

植物乳桿菌種子培養液對高產酯釀酒酵母生長和酒精發酵的影響結果見表3。由表3可知，發酵12 h時，添加植物乳桿菌種子培養液對高產酯釀酒酵母的生長有所抑制，酵母數分別下降20%、20%、30%、33%；而發酵到24 h時，即使添加了植物乳桿菌種子培養液，酵母數量與對照（植物乳桿菌種子液接種量為0時）相比也無顯著差異，酵母數量在（1.90～2.10）×109CFU/mL，說明添加植物乳桿菌種子培養液后，前12 h高產酯釀酒酵母生長緩慢，這和植物乳桿菌與酵母競爭營養物質有關，而在發酵12～24 h時，高產酯釀酒酵母逐漸成為優勢菌群，進入了生長旺盛期。添加植物乳桿菌種子液對發酵結束高產酯釀酒酵母乙醇產量有略微提高，相應的發酵結束后的殘糖量有所降低，在植物乳桿菌種子液接種量為0時，釀酒酵母乙醇產量為74.08 g/L；在植物乳桿菌種子液接種量為16.0%時，釀酒酵母乙醇產量為76.77 g/L。

表3 不同植物乳桿菌種子液添加量對高產酯釀酒酵母生長和酒精發酵的影響Table 3 Effects of different seed solution addition of Lactobacillus plantarum on the growth of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae and alcoholic fermentation

植物乳桿菌種子液對高產酯釀酒酵母MY-15主要風味物質的影響結果見圖2。

圖2 不同植物乳桿菌種子液添加量對高產酯釀酒酵母主要風味物質的影響Fig.2 Effects of different seed solution addition of Lactobacillus plantarum on major flavor substances of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae

由圖2可知，植物乳桿菌種子液對高產酯釀酒酵母MY-15酯代謝有一定影響，當植物乳桿菌種子液添加量為16.0%時，乙酸乙酯含量變化最大，增加了39.82%。在植物乳桿菌種子液各添加量下對高產酯釀酒酵母乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的產量影響不大。植物乳桿菌種子培養液對高產酯釀酒酵母MY-15高級醇代謝的影響各有不同，正丙醇隨著植物乳桿菌種子培養液添加量的增加而增加，在植物乳桿菌種子液添加量為16.0%時，正丙醇含量增加31.67%；異丁醇和異戊醇含量在植物乳桿菌種子液接種量為16.0%時稍有下降，下降了8.4%；活性戊醇和苯乙醇含量都是隨著植物乳桿菌種子培養液添加量的增加而減少，在植物乳桿菌種子培養液添加量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%時，與對照（植物乳桿菌種子液接種量為0）相比，苯乙醇含量分別下降了30.34%、49.3%、59.24%、65.92%；活性戊醇含量分別下降了18.85%、29.96%、36.26%、46.03%。

2.3 不同乳酸含量對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響

培養基內不同乳酸含量對高產酯釀酒酵母MY-15生長及酒精發酵的影響結果見表4。由表4可知，發酵12 h和24 h時，培養基內乳酸質量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時，釀酒酵母數量下降明顯，酵母數量下降明顯，與對照相比，發酵12 h時，酵母數分別下降19.21%和27.81%；發酵24 h時，酵母數分別下降9.47%和13.61%，說明在培養基內乳酸質量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時對高產酯釀酒酵母前24 h的生長有所抑制。與對照相比，培養基內乳酸質量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時釀酒酵母乙醇產量有所提高，分別提高了1.56%和5.64%。

表4 不同乳酸含量對高產酯釀酒酵母生長和酒精發酵的影響Table 4 Effects of different lactic acid contents on the growth of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae and alcoholic fermentation

培養基內不同初始乳酸含量對高產酯釀酒酵母主要風味物質代謝的影響見圖3。由圖3可知，培養基內不同初始乳酸含量對高產酯釀酒酵母MY-15酯代謝有一定影響，與對照相比，當培養基內乳酸質量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時，釀酒酵母乙酸乙酯含量增加了39.51%和39.49%。乙酸異戊酯隨著培養基內乳酸含量的增加而減少，與對照相比，培養基內初始乳酸含量為1.8 g/L、3.5 g/L、5.3 g/L、7.1 g/L時釀酒酵母乙酸異戊酯分別減少了21.27%、25.89%、30.65%、39.97%。培養基內不同初始乳酸含量對釀酒酵母MY-15高級醇代謝的影響各有不同，正丙醇隨著培養基內植物乳桿菌發酵液的增多而增多，在培養基內初始乳酸質量濃度為1.8 g/L、3.5 g/L、5.3 g/L、7.1 g/L時，與對照相比，正丙醇含量增加了20.28%、40.11%、50.21%、70.33%。釀酒酵母異丁醇含量在培養基內初始乳酸濃度為1.8 g/L、3.5g/L時，與對照相比有所增加，分別增加了11.23%和8.79%，而當培養基內初始乳酸質量濃度為5.3 g/L、7.1 g/L時，釀酒酵母異丁醇含量與對照相比分別降低了14.23%和19.5%。釀酒酵母異戊醇和苯乙醇含量隨著培養基內乳酸質量濃度的增加而逐漸降低，與對照相比，異戊醇含量分別下降了16.67%、33.33%、41.67%、75.01%；苯乙醇含量分別下降了25.05%、48.65%、62.35%、75.64%，這可能與培養基內酸濃度的增高及培養基中各氨基酸的含量不同有關系。

圖3 不同乳酸含量對高產酯釀酒酵母主要風味物質的影響Fig.3 Effects of different lactic acid contents on major flavor substances of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae

3 結論

該研究在高粱汁培養基內同時接種植物乳桿菌（Lac tobacillusplantarum）和高產酯釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），探究植物乳桿菌及其代謝產物對高產酯釀酒酵母酒精發酵及酯醇代謝的影響。結果表明，植物乳桿菌菌懸液及種子液各接種量下對高產酯釀酒酵母生長及酒精發酵的影響不大，發酵72 h后殘糖量都在5 g/L以內，乙醇產量為74～78 g/L，但植物乳桿菌菌懸液及種子液使高產酯釀酒酵母乙酸酯和高級醇產量降低。培養基內含有少量乳酸（質量濃度1.8～7.1 g/L）能夠使高產酯釀酒酵母乙酸酯產量提高，并且降低高級醇的產量，尤其是苯乙醇的產量下降明顯。

白酒生產是多菌群混合發酵，發酵過程中參與的微生物種類繁多，而且不同的微生物對釀酒酵母的影響各有不同，本實驗研究了植物乳桿菌對高產酯釀酒酵母酒精發酵、乙酸酯及高級醇代謝的影響，為高產酯釀酒酵母的實際應用提供了理論依據，但想要透徹了解相互作用機理，還需從轉錄組學及分子生物學進行更深層次的研究。