不同陳釀期松針酵素生物活性變化規律研究

李 彥，周文化 *，羅奡劼，陳嘉琳，陳露茜，劉裕龍，譚越兮

（1.中南林業科技大學 特醫食品加工湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中南林業科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；3.湖南恩松生物科技有限公司，湖南 湘潭 411100）

松針（Pinus armandiFranch）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的葉，含有豐富的營養物質和生理活性成分，具有鎮咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抗衰老、消炎抑菌等[1]作用。松針在我國分布廣泛，價格低廉，將松針資源進行深度開發和利用具有重要的意義。

酵素食品是指以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、藥食同源中草藥等為原料，經多種有益菌發酵而成的功能性產品，含有豐富的酶、維生素、礦物質和次生代謝產物等營養成分[2]，具有抗氧化[3]、美白[4]、增強免疫力[5]及改善肥胖[6]的功效。近年來，關于酵素酶系及抗氧化活性研究較多，如張夢梅等[7]檢測了市售酵素的酶系；趙光遠等[8]研究了紅棗酵素在發酵過程中的活性酶系及相關代謝產物的變化規律；王輝等[9]研究了青梅酵素的抗氧化活性、活性酶系及抑菌效果等，這些報道集中在某種酵素的活性物質的檢測或是發酵過程中活性物質的變化研究，關于酵素陳釀期間生物活性的變化研究鮮有報道。

本研究以不同陳釀期的松針酵素為研究對象，采用國標中的方法及試劑盒準確測定松針酵素中的活性酶系，并以還原力、超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力、羥基自由基（·OH）清除能力、1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）自由基清除能力為抗氧化性指標對松針酵素的抗氧化性能進行檢測分析。以期探討松針酵素陳釀過程中活性酶系及抗氧化活性的變化規律，科學評價松針酵素的抗氧化活性及其品質，為評估松針酵素的功能及產品質量的改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

松針、松花粉、松子、沙棘、柚子、胡蘿卜、菊花、檸檬、橘子、玫瑰花、桂花：湖南恩松生物科技有限公司；安琪牌葡萄酒用高活性干酵母、發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CECT5716、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）M-16V：中科院微生物研究所。

1.1.2 試劑

DPPH、乙醇、ABTS、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、Tris、鄰苯三酚、淀粉酶試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、鹽酸、酪蛋白、酪氨酸、福林酚、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、聚乙烯醇、橄欖油、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、無水硫酸鈉、酒石酸鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團化學試劑有限公司。實驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

YP-B10001分析天平：上海光正醫療儀器有限公司；BlueStar B紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；PHSJ-3FpH計：上海圣科儀器設備有限公司；TG16MW臺式高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；84-1磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；FA25-D剪切機：上海弗魯克科技發展公司；BET-40生化培養箱：天津天大天發科技有限公司；SpectraMa酶標儀：美國Molecular Device公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 松針酵素制備工藝流程及操作要點

原料→清洗→熱燙、瀝干→研磨→酵母發酵→混合發酵→后熟→松針酵素

操作要點：選取松針、松花粉、松子等原料，用清水洗滌后熱燙15 min，冷卻瀝干后加水研磨得到混合果漿，加入22%紅糖和33%冰糖，溶解均勻，再加入0.8%活化后的干酵母，置于22 ℃條件下發酵18 d，再接種6%短雙岐桿菌M-16V和發酵乳桿菌CECT5716的混合菌液（短雙岐桿菌M-16V∶發酵乳桿菌CECT5716=1.0∶1.5），混合發酵結束后即得松針酵素成品。松針酵素于4 ℃低溫陳釀，分別取陳釀半年、一年、兩年、三年、四年的松針酵素，4 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，取上清液測定各指標。

1.3.2 活性酶的測定

蛋白酶：參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》，以酪氨酸的質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制酪氨酸標準曲線，按照標準曲線回歸方程y=0.174 8x-0.055 6（R2=0.999 1）計算樣品中酪氨酸的含量。蛋白酶活力定義：在40 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產生l μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）。

纖維素酶：參照NY/T 912—2004《纖維素酶活力的測定-分光光度計法》，以葡萄糖的質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，按照標準曲線回歸方程y=0.907 3x+0.085 5（R2=0.999 6）計算樣品中纖維素酶水解羧甲基纖維素鈉產生的還原糖含量，再根據公式換算成樣品中纖維素酶的含量。纖維素酶活力定義：在37℃、pH值為5.5的條件下，每分鐘從質量濃度為4 mg/mL的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

脂肪酶：參照GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》中的電位滴定法測定。脂肪酶活力定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在一定溫度和pH值條件下，1 min水解底物產生1 mol可滴定的脂肪酸即為1個酶活力單位（U）。

淀粉酶：參考淀粉酶試劑盒內說明書測定。淀粉酶活力定義：在60 ℃、pH值6.0的條件下，1 h液化1 g可溶性淀粉所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

SOD：參考SOD試劑盒內說明書測定。SOD活力定義：25 ℃時抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時所需的SOD量為一個活力單位（U）。

1.3.3 抗氧化能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考SHARMA O P等[10]的方法；ABTS自由基清除能力的測定參照MUSTAFA O等[11]的方法；羥基自由基清除能力的測定參照SHUANG L X等[12]的方法；超氧自由基清除能力的測定參照DU G等[13]的方法；還原力的測定參考SABOKBAR N等[14]的方法。

1.3.4 數據處理

在Excel 2013中對試驗數據進行整理。采用OriginPro8.0分析軟件對數據進行差異顯著性分析及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 松針酵素陳釀期間活性酶的變化

酵母菌發酵混合果漿不但保留了原材料中的營養成分，而且通過微生物的代謝產生了新的活性酶，賦予了松針酵素極強的保健功能，這些活性酶主要包括SOD、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶。SOD是一種特殊的金屬酶，能有效清除機體內的的超氧陰離子自由基，對生物體來說是一道保護屏障，且具有抗氧化、防衰老、抗輻射等多種功效，廣泛應用于醫藥領域[15]；蛋白酶不僅能促進蛋白質的水解，還能分解瀕臨凋亡的細胞，具有促消化和美容的功效[16]；脂肪酶是一類水解油脂的酶類，主要作用于油脂中的脂肪酸和甘油相連接的酯鍵，水解底物一般為天然油脂，廣泛應用于減肥產品及保健品中[17]；淀粉酶能夠催化淀粉水解，具有促進人體消化的功能；纖維素酶能夠將纖維素分解為葡萄糖，改善人體的消化系統。松針酵素陳釀期間活性酶活力的變化見圖1。

圖1 松針酵素陳釀期間活性酶活力的變化Fig.1 Changes of active enzyme activities in pine needle Jiaosu during aging periods

由圖1可知，在松針酵素中存在SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，且5種酶活性均隨陳釀時間的延長逐漸降低。與之前研究相符，不同陳釀期松針酵素的蛋白質含量隨著陳釀時間的延長而降低[18]。陳釀初期，蛋白酶活力和SOD活力較高，分別為427.66 U/mL、258.67 U/mL；淀粉酶、纖維素酶以及脂肪酶活力較低，分別為12.95 U/mL、6.92 U/mL和1.90 U/mL。陳釀末期，蛋白酶活力最高，其次是SOD、纖維素酶和淀粉酶，脂肪酶活力最低，分別為241.54 U/mL、163.51 U/mL、4.98 U/mL、1.52 U/mL、0.33 U/mL。在整個陳釀期間，淀粉酶和脂肪酶活力下降最多，分別下降88.26%和82.63%；蛋白酶、SOD、纖維素酶活力分別下降43.52%、36.79%、28.03%。

董銀卯等[3]使用酵母菌發酵制備火龍果酵素，測得其SOD、淀粉酶和脂肪酶活力分別為300 U/mL、33.2 U/mL、1.8 U/mL；周偏等[19]研究發現，諾麗酵素活性較高，其中SOD活性和淀粉酶活性分別達到376.43U/mL和17.65U/mL；崔國庭等[20]研究發現，草莓酵素的SOD活力為35.4 U/mL，淀粉酶活力為3.26 U/mL；邵穎等[21]考察了植物酵素發酵過程中SOD、纖維素酶、蛋白酶等幾種酶活性的變化規律，發現在發酵終點時，SOD活力為（49.29±2.02）U/mL、纖維素酶活力為（319.71±8.19）U/mL、蛋白酶活力為（12.51±1.31）U/mL。與火龍果酵素相比，松針酵素中的SOD、淀粉酶活力略低，但脂肪酶活力相差不大；與諾麗酵素相比，SOD及淀粉酶活性較弱；松針酵素中的SOD及蛋白酶活性高于植物酵素，但纖維素酶活性卻低于植物酵素；草莓酵素中的SOD及淀粉酶活性遠不及松針酵素。各個酵素中酶活力出現不同的原因，可能是由于酵素生產工藝的不同，如高溫殺菌致使酵素中的酶失活；也有可能是原料種類及比例的不同，在未發酵之前，原料本身含有的活性物質會有很大的差異；還有可能是菌種的選擇、發酵方式、發酵時間的不同引起的。

2.2 松針酵素陳釀期間抗氧化能力的變化趨勢

松針酵素經酵母發酵、短雙歧桿菌和發酵乳桿菌混合發酵后得到具有較高活性物質以及活性酶的松針發酵液，這些功能活性成分會增加松針發酵液的體外抗氧化活性，通過對發酵過程中各類抗氧化活性指標（還原力、ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力及羥基自由基清除能力）的檢測，從而判斷松針酵素在陳釀期抗氧化活性的變化趨勢。

2.2.1 松針酵素陳釀期間還原力的變化趨勢

圖2 松針酵素陳釀期間還原力的變化趨勢Fig.2 Change of reducing power of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖2可知，隨著陳釀時間的延長，松針酵素還原力逐漸減小，還原力由最初的0.54下降至0.39，下降27.78%，說明陳釀會導致松針酵素還原能力減弱。分析原因可能是陳釀期間發酵體系中各分子進行氧化還原、酯化、縮合、聚合等一系列反應，導致還原能力減弱。

2.2.2 松針酵素陳釀期間超氧陰離子自由基清除率的變化趨勢

圖3 松針酵素陳釀期間超氧陰離子自由基清除率的變化趨勢Fig.3 Change of superoxide anion radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖3可知，陳釀半年的松針酵素對超氧陰離子自由基清除能力高達92.93%，隨著陳釀時間的延長，呈現稍有下降的趨勢，總體下降6.9%。分析原因可能與陳釀期間SOD活力不斷下降有關，ZYRACKA E等[15]研究表明，SOD能催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，從而達到清除超氧陰離子自由基的目的；另一方面可能是因為陳釀期間發酵液體系中活性物質持續下降。

2.2.3 松針酵素陳釀期間羥基自由基清除率的變化趨勢

圖4 松針酵素陳釀期間羥基自由基清除率的變化趨勢Fig.4 Change of hydroxyl radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖4可知，陳釀半年的松針酵素對羥基自由基清除能力最高達60.57%，但隨著陳釀期的延長羥基自由基清除能力不斷減弱，陳釀第4年羥基自由基清除率只有31.77%，總體下降28.8%。其原因可能是陳釀期間松針酵素中的營養物質不斷下降，發酵菌的生長繁殖受到抑制，產生可以清除羥基自由基的抗氧化酶類也隨之減少；也有文獻報道，發酵菌本身就具備抗氧化能力，如酵母菌的細胞多糖能有效清除羥基自由基[22]。LEE J等[23]研究發現，黃酮類化合物能有效清除羥基和超氧陰離子自由基，與金屬形成復合物，并抑制金屬引發的脂質氧化。因此，松針酵素對羥基自由基清除能力與發酵菌、抗氧化酶類以及黃酮類化合物有關。

2.2.4 松針酵素陳釀期間DPPH自由基清除率的變化趨勢

圖5 松針酵素陳釀期間DPPH自由基清除率的變化趨勢Fig.5 Change of DPPH radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖5可知，松針酵素的DPPH自由基清除能力隨著陳釀時間的延長呈升高后略下降的趨勢。韋仕靜等[24-25]研究發現，酚類物質含量與DPPH自由基清除率呈一定的相關性；SHAHIDI F等[25]研究發現，有機酸、維生素和具有自由羥基的酚類物質都可以有效清除自由基。因此，松針酵素對DPPH自由基的清除能力不僅與發酵液體系中的多酚物質有關，還與有機酸、維生素等其他活性物質相關。

2.2.5 松針酵素陳釀期間ABTS自由基清除率的變化趨勢

圖6 松針酵素陳釀期間ABTS自由基清除率的變化趨勢Fig.6 Change of ABTS radical scavenging rate of pine needle Jiaosu during aging periods

由圖6可知，松針酵素對ABTS自由基清除率高達98.91%，且在陳釀期間，變化較小，說明不同陳釀時間松針酵素發酵液均表現出很強的ABTS自由基清除能力，且對ABTS的清除能力非常穩定。孫淑夷[26]研究發現，荔枝汁酵素在發酵16 h后ABTS自由基清除率高達98%，發酵16 h后ABTS自由基清除率較為穩定；陳小偉等[27]研究發現，不同發酵時間諾麗酵素對ABTS自由基的清除率差異不大。因此，松針酵素不僅對ABTS自由基的清除率高，且能在一定時間范圍內保持穩定。

綜上，松針酵素的抗氧化活性隨著陳釀時間的延長而降低，但對DPPH自由基的清除率稍有增加。

2.3 松針酵素陳釀過程中活性酶和抗氧化能力的相關性分析

采用Pearson法對松針酵素陳釀過程中脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、SOD和纖維素酶與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥基自由基清除能力和總還原力能力的相關性進行分析，結果見表1。

由表1可知，DPPH、超氧陰離子自由基清除能力與羥基自由基清除能力、淀粉酶活力及蛋白酶活力呈顯著相關（P＜0.05），DPPH自由基清除能力與纖維素酶活力呈極顯著相關（P＜0.01），超氧陰離子自由基清除能力與還原力呈極顯著相關（P＜0.01），與SOD活力呈顯著相關（P＜0.05）；羥基自由基清除能力除與ABTS自由基清除能力無顯著相關外（P＞0.05），與其他指標都相關，其中與還原力、淀粉酶活力及SOD活力呈極顯著相關（P＜0.01）；還原力與SOD活力呈極顯著相關（P＜0.01）；脂肪酶活力與淀粉酶活力、蛋白酶活力呈極顯著相關（P＜0.01）；淀粉酶與蛋白酶活力呈極顯著相關（P＜0.01）；ABTS與各指標無顯著相關性（P＞0.05）。5種活性酶活力與5個抗氧化指標具有一定的相關性，可以通過測定松針酵素中的活性酶含量來表征其抗氧化特性。

表1 松針酵素中活性酶和抗氧化能力的相關性分析Table 1 Correlation analysis of active enzymes and antioxidant ability in pine needle Jiaosu

3 結論

不同陳釀期松針酵素中含有豐富的活性酶類，包括SOD、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶，在陳釀初期，5種酶活力最高，分別為258.67 U/mL、12.95 U/mL、427.66 U/mL、1.90 U/mL、6.92 U/mL；但隨陳釀時間的延長，5種活性酶活力均逐漸降低，酶活力分別下降36.79%、88.26%、43.52%、82.63%、28.03%。

不同陳釀期松針酵素具有良好的抗氧化能力，在整個陳釀期間，對超氧陰離子自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均＞85%，相對穩定。隨著陳釀時間的延長，還原力和羥基自由基清除能力減弱，而DPPH自由基清除能力增加。

松針酵素活性酶與抗氧化性相關分析結果表明，5種活性酶活力與5個抗氧化指標具有一定的相關性，可以通過測定松針酵素中的活性酶含量來表征其抗氧化特性。