納豆芽孢桿菌TK-2產(chǎn)γ-聚谷氨酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

王振強(qiáng)，賈俊偉，王 浩，婁軍暉

（1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開封 475003；2.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；3.旭梅（開封）生物科技有限公司，河南 開封 475003）

納豆是日本傳統(tǒng)的發(fā)酵食品之一，起源于我國(guó)的豆豉[1]。唐朝時(shí)期，鑒真和尚東渡日本將豆豉帶到了那里，逐漸演變成為納豆[2-3]。在我國(guó)，李時(shí)珍的《本草綱目》中就已經(jīng)有豆豉可以入藥的記載[4]；在日本民間，納豆長(zhǎng)期應(yīng)用于治療傷寒、痢疾等疾病[5-6]。20世紀(jì)日本研究者須見洋行首次從納豆中分離出一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），并發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的納豆激酶具有良好的溶解血栓的功能[7]。1905年，SAUMUR從納豆中分離出一株γ-聚谷氨酸生產(chǎn)菌，命名為B.nattoSawamura[8]，后來FUJI等學(xué)者又證明納豆中含有γ-聚谷氨酸[9]。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamate acid，γ-PGA）是一種由微生物發(fā)酵合成的氨基酸聚合物，通過谷氨酸的α-NH2和γ-COOH以酰胺鍵結(jié)合形成[10]。γ-PGA主鏈上存在大量肽鍵，在自然界或人體內(nèi)可生物降解成短肽小分子和氨基酸單體，不產(chǎn)生毒副作用[11]，分子鏈上具有大量的活性較高的游離側(cè)鏈羧基（-COOH），易于和一些藥物結(jié)合生成穩(wěn)定的復(fù)合物[12]，具有優(yōu)良的生物兼容性和生物降解性，是理想的可生物吸收的醫(yī)藥用高分子材料[13]。本試驗(yàn)選取從納豆中分離的納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）TK-2菌株，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，具有容易操作和控制，生產(chǎn)成本較低，產(chǎn)率較高的特點(diǎn)。γ-PGA對(duì)環(huán)境無污染，為綠色生物產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥制造，食品加工，蔬菜、水果、海產(chǎn)品的防凍、保鮮及植物種子保護(hù)等許多領(lǐng)域，是一種具有極大開發(fā)價(jià)值和廣闊應(yīng)用前景的多功能新型生物制品[14]。本研究通過單因素以及正交試驗(yàn)對(duì)Bacillus nattoTK-2產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatogramphy，HPLC）分析，為γ-PGA的綜合開發(fā)利用提供理論支撐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與試劑

Bacillus nattoTK-2菌種：學(xué)校食品工程實(shí)驗(yàn)室提供；蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、味精等（均為食品級(jí)）、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、尿素、乙醇、硝酸鈉、氫氧化鈉、檸檬酸、硝酸鉀等（均為分析純）：北京百靈威科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH 7.2，121 ℃，0.1 MPa，滅菌15 min。種子液培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.26%，pH 7.2，121 ℃，0.1MPa，滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源2.5%，味精2%，氮源3%，MgSO4·7H2O 0.05%，K2HPO4·3H2O 0.26%，pH 7.2，分裝于250 mL的搖瓶中，每瓶裝液50 mL，121 ℃，0.1 MPa，滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CX43光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；LRH250C生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器材廠；冷凍干燥機(jī)：美國(guó)KENDRO公司；756型紫外/可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；PHSJ-4A型pH計(jì)：上海雷磁公司；AvantiJXN-30型高效離心機(jī)：BECKMAN COULTER公司；LC-100PHP型高效液相色譜儀：杭州俊升科學(xué)器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的培養(yǎng)

將菌株TK-2接種于肉湯培養(yǎng)基，37 ℃活化培養(yǎng)1 d，再接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、170 r/min培養(yǎng)12 h，按一定接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、140 r/min條件下培養(yǎng)。

1.3.2 納豆芽孢桿菌TK-2生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

利用分光光度法測(cè)定[15]。取29 mL空白液再加入1 mL發(fā)酵液，混合均勻，倒入比色皿中，在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)定OD660nm值，每隔2 h測(cè)定1次，直至菌種由生長(zhǎng)期進(jìn)入到衰退期。

1.3.3γ-聚谷氨酸的純化

（1）菌體的分離

將發(fā)酵液12 000 r/min、4 ℃條件下離心30 min，取上清液備用。

（2）乙醇沉淀

在上清液中緩慢加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇提取，加入后出現(xiàn)蛋清狀的物質(zhì)，緩慢旋轉(zhuǎn)搖瓶，使蛋清狀物質(zhì)慢慢成團(tuán)聚集，最后用鑷子夾出，用去離子水洗滌沉淀物[16]。

（3）丙酮沉淀

將乙醇沉淀后的粗樣品溶解在0.015 mol/L、pH 7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中，加入4倍體積的丙酮，緩慢旋轉(zhuǎn)搖瓶，使蛋清狀物質(zhì)慢慢成團(tuán)聚集，最后用鑷子夾出，用去離子水洗滌沉淀物[17]。

（4）透析除鹽

把丙酮沉淀提取的沉淀物倒入截流分子質(zhì)量8 000～12 000 Da的透析袋內(nèi)，每隔2 h換1次水，4 ℃冰箱中保存，透析6 h，取出進(jìn)行冷凍干燥稱其質(zhì)量[18]。

1.3.4γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的測(cè)定

將純化后的γ-聚谷氨酸冷凍干燥后稱質(zhì)量，計(jì)算其產(chǎn)量。

式中：M為制備的γ-聚谷氨酸質(zhì)量，g；V為發(fā)酵液的體積，L。

1.3.5 HPLC分析

稱取谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣0.1 g，用蒸餾水定容至10 mL，取1 mL為待測(cè)谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣溶液。稱取提純的γ-聚谷氨酸0.1 g，用蒸餾水定容到10 mL，在封閉的磨口水解管中加入1 mLγ-聚谷氨酸溶液和10 mL的6 mol/L的鹽酸，37 ℃，水解24 h，12 000 r/min離心30 min，取上清液1 mL為待測(cè)γ-聚谷氨酸水解液。

HPLC條件：熒光檢測(cè)器；HydrosphereC18分析柱（4.6mm×25mm）；流動(dòng)相：體積比為6∶4的乙腈水溶液；流速：0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：發(fā)射波長(zhǎng)350 nm，激發(fā)波長(zhǎng)450 nm；用0.45 μm的濾膜將樣品過濾除去雜質(zhì)；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）碳源種類及添加量的選擇

選取葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蘋果酸、乙酸、麥芽糖、可溶性淀粉、檸檬酸、甘油等10種碳源，按2%水平分別加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳碳源。選取最佳碳源，按1%～8%的水平分別加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定碳源最佳添加量。

（2）氮源種類及添加量的選擇

選取酵母浸粉、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏、NH4Cl、尿素、KNO3、NaNO3、（NH4）2SO4、NH4NO310種氮源，按2.5%水平分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳氮源。選取最佳氮源，按0.5%～4.0%的水平分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定氮源最佳添加量。

（3）味精添加量的選擇

味精按1%～7%的水平分別加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-PGA含量，確定最佳味精添加量。

（4）初始pH值的選擇

選取發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳初始pH值。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取碳源、氮源、味精的添加量3個(gè)因素，以γ-PGA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)[19]。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization

1.3.8 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

（1）裝液量的選擇

選取裝液量分別為30 mL/250 mL、40 mL/250 mL、50mL/250mL、60mL/250mL、70mL/250mL、80mL/250mL、90 mL/250 mL，接種量2%，37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定γ-PGA含量，確定最佳的裝液量。

（2）接種量的選擇

裝液量為70mL/250 mL，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%，37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳接種量。

（3）培養(yǎng)溫度的選擇

裝液量為70 mL/250 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度分別為28 ℃、32 ℃、37 ℃、40 ℃、42 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳培養(yǎng)溫度。

（4）轉(zhuǎn)速的選擇

裝液量為70 mL/250 mL，接種量2%，37 ℃，轉(zhuǎn)速分別為80 r/min、110 r/min、140 r/min、170 r/min、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定γ-PGA產(chǎn)量，確定最佳的轉(zhuǎn)速。

1.3.9 發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線的繪制

在優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵培養(yǎng)30 h，每隔3 h從搖床上取下一瓶，測(cè)定發(fā)酵液的γ-PGA產(chǎn)量及其在波長(zhǎng)660 nm處的OD660nm值，繪制Bacillus nattoTK-2的發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌TK-2的生長(zhǎng)曲線

每隔2 h測(cè)定波長(zhǎng)660 nm處種子的OD660nm值，測(cè)定30 h菌種的生長(zhǎng)狀態(tài)，直至菌種由生長(zhǎng)期進(jìn)入到衰退期，生長(zhǎng)曲線如圖1。

圖1 納豆芽孢桿菌TK-2生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto TK-2

由圖1可以看出，納豆菌生長(zhǎng)6 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期，在12 h時(shí)把種子液接種到發(fā)酵液中。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

2.2.1 碳源種類及添加量的確定

裝液量為70 mL/250 mL，接種量2%，37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。不同的碳源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖2，碳源添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3。

圖2 不同碳源對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on γ-polyglutamic acid yield

由圖2可以看出，葡萄糖和蔗糖做為碳源的γ-PGA的產(chǎn)量比麥芽糖等其他碳源相對(duì)較好，可能是葡萄糖和蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源比較有利于菌體的發(fā)酵反應(yīng)。結(jié)合經(jīng)濟(jì)條件考慮，選擇葡萄糖為最佳碳源比較合適。

圖3 葡萄糖添加量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of glucose addition on γ-polyglutamic acid yield

由圖3可以看出，隨著葡萄糖添加量的增加，發(fā)酵液中的γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)葡萄糖添加量為2%時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量最高。再增加葡萄糖添加量，γ-PGA產(chǎn)量逐漸降低。這是因?yàn)楫?dāng)葡萄糖添加量太低時(shí)，不夠菌體生長(zhǎng)所需；而當(dāng)葡萄糖添加量過大時(shí)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)及γ-PGA的生成有抑制作用。綜合分析，選擇葡萄糖添加量為2%比較合適。

2.2.2 氮源種類及添加量的確定

裝液量為70 mL/250 mL，接種量2%，37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。不同的氮源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖4，氮源添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖5。

圖4 不同氮源對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on γ-polyglutamic acid yield

由圖4可以看出，蛋白胨、牛肉膏等有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵液中生成γ-PGA產(chǎn)量比氯化銨、硫酸銨等無機(jī)氮源高。而有機(jī)氮源中蛋白胨對(duì)發(fā)酵液的γ-PGA產(chǎn)量的效果要優(yōu)于其他的有機(jī)氮源，可能是蛋白胨做為培養(yǎng)基中的有機(jī)氮源更有利于菌體的發(fā)酵反應(yīng)。綜合分析，選擇蛋白胨為最優(yōu)氮源。

圖5 蛋白胨添加量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of peptone addition on γ-polyglutamic acid yield

由圖5可以看出，隨著蛋白胨添加量逐漸增大，發(fā)酵液中的γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.5%時(shí)，發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量最高，而再增加蛋白胨添加量，γ-PGA產(chǎn)量逐漸降低。這是由于發(fā)酵反應(yīng)初期，菌體的濃度比較大，隨著蛋白胨添加量的加大，菌體與蛋白胨接觸比較充分，發(fā)酵反應(yīng)比較充分，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，菌體逐漸消耗，即使增大蛋白胨添加量，發(fā)酵反應(yīng)程度也會(huì)降低。綜合分析，選擇蛋白胨添加量為2.5%比較合適。

2.2.3 味精添加量的確定

裝液量為70 mL/250 mL，接種量2%，37 ℃、140r/min振蕩培養(yǎng)24h。味精不同添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖6。

由圖6可以看出，隨著味精添加量的增加，發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)味精添加量為2%時(shí)，發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量最高。再增加味精添加量，γ-PGA產(chǎn)量逐漸降低。這是由于發(fā)酵反應(yīng)初期，菌體的濃度比較大，隨著味精添加量的加大，菌體與味精接觸比較充分，發(fā)酵反應(yīng)比較充分，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，菌體逐漸消耗，濃度降低，即使增大味精添加量，發(fā)酵反應(yīng)程度也會(huì)降低。綜合分析，選擇味精添加量為2%比較合適。

圖6 味精添加量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of monosodium glutamate addition on γ-polyglutamic acid yield

2.2.4 初始pH值的確定

裝液量為70 mL/250 mL，接種量2%，37 ℃、140r/min振蕩培養(yǎng)24 h。不同初始pH值對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖7。

圖7 初始pH值對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of initial pH on γ-polyglutamic acid yield

由圖7可以看出，隨著初始pH值的增大，發(fā)酵液中的γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)初始pH值為7.5時(shí)，發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量最大。再增大初始pH值，γ-PGA產(chǎn)量顯著降低。這是因?yàn)榘l(fā)酵過程中，初始pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度和微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，過酸性或過堿性環(huán)境都不利于菌種的發(fā)酵生長(zhǎng)，初始pH值為7.5時(shí)比較有利于發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行。綜合分析，選擇初始pH值為7.5比較合適。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和味精添加量3個(gè)因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2、方差分析結(jié)果見表3。

由表2和表3可以看出，最佳培養(yǎng)基配方為A3B2C2，即葡萄糖添加量2.5%，蛋白胨添加量2.5%，味精添加量2%。葡萄糖添加量、蛋白胨添加量和味精添加量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響因素大小為：A＞C＞B，即葡萄糖添加量＞味精添加量＞蛋白胨添加量，葡萄糖添加量具有顯著性的影響（P＜0.05），蛋白胨添加量和味精添加量均無顯著性的影響（P＞0.05）。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium formula optimization

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

綜上所述，根據(jù)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化，發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，味精2%，pH 7.5。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.4.1 裝液量的確定

圖9 裝液量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of loading volume on γ-polyglutamic acid yield

不同裝液量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖8。由圖8可以看出，隨著裝液量的增加，γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)裝液量達(dá)到70 mL/250 mL時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量最高。再增大裝液量，γ-PGA產(chǎn)量有較大幅度降低。綜合分析，選擇裝液量為70mL/250mL比較合適。

2.4.2 接種量的確定

不同接種量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖9。由圖9可以看出，隨著接種量的增加，發(fā)酵液中的γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)接種量為2%時(shí)，發(fā)酵液γ-PGA產(chǎn)量最大。再增加接種量，γ-PGA產(chǎn)量緩慢降低。這是因?yàn)榘l(fā)酵反應(yīng)初期，菌體的濃度比較大，隨著接種量的加大，菌體與種子接觸比較充分，發(fā)酵反應(yīng)比較充分，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，菌體逐漸消耗，濃度降低，即使增大接種量，發(fā)酵反應(yīng)程度也會(huì)降低。綜合分析，選擇接種量為2%比較合適。

圖9 接種量對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of inoculum on γ-polyglutamic acid production

2.4.3 發(fā)酵溫度的確定

不同溫度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖10。由圖10可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵液中的γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量最大。再升高培養(yǎng)溫度，γ-PGA產(chǎn)量顯著降低。這是因?yàn)榘l(fā)酵反應(yīng)初期，菌體的濃度比較大，升高溫度可以加快發(fā)酵反應(yīng)速度，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，菌體逐漸消耗，濃度降低，發(fā)酵反應(yīng)程度也會(huì)降低。綜合分析，選擇培養(yǎng)溫度為37 ℃比較合適。

圖10 發(fā)酵溫度對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of fermentation temperature on γ-polyglutamic acid yield

2.4.4 轉(zhuǎn)速的確定

不同轉(zhuǎn)速對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖11。由圖11可以看出，隨著轉(zhuǎn)速的加大，發(fā)酵液中的γ-PGA產(chǎn)量逐漸增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到140 r/min時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量最大。再加大轉(zhuǎn)速，γ-PGA產(chǎn)量開始降低。這是因?yàn)榘l(fā)酵反應(yīng)初期，菌體的濃度比較大，加大轉(zhuǎn)速可以加快發(fā)酵反應(yīng)速度，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，菌體逐漸消耗，濃度降低，發(fā)酵反應(yīng)程度也會(huì)降低。綜合分析，選擇轉(zhuǎn)速為140 r/min比較合適。綜上所述，最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：裝液量70 mL/250 mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，γ-PGA產(chǎn)量為11.48 g/L，產(chǎn)量提高了57.2%。

圖11 轉(zhuǎn)速對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響Fig.11 Effect of shaking speed on γ-polyglutamic acid yield

2.5 發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線

在優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵30 h，每隔3 h從搖床上取下一瓶，測(cè)定波長(zhǎng)660 nm處的OD660nm值，繪制Bacillus nattoTK-2的發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線如圖12，γ-PGA的產(chǎn)量動(dòng)態(tài)曲線如圖13。

圖12 Bacillus natto TK-2的發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線Fig.12 Fermentation dynamic curve of Bacillus natto TK-2

由圖12、圖13可以看出，菌體在最佳發(fā)酵條件下能夠快速的生長(zhǎng)，經(jīng)過3 h很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在21 h菌體進(jìn)入平穩(wěn)期。γ-聚谷氨酸的生成基本上與菌體的生長(zhǎng)同步，從0～12 h生產(chǎn)γ-聚谷氨酸是緩慢的，在12～24 h能夠較快速度地生成γ-PGA。之后隨著發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，γ-PGA的產(chǎn)量趨于穩(wěn)定并且有下降的趨勢(shì)。

圖13 γ-PGA的產(chǎn)量動(dòng)態(tài)曲線Fig.13 Dynamic curve of γ-PGA yield

2.6 HPLC分析

谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和γ-PGA水解溶液的高效液相色譜圖如圖14所示。

圖14 谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）以及γ-聚谷氨酸水解溶液（B）的高效液相色譜圖Fig.14 HPLC chromatogram of glutamate acid standard (A) and γ-polyglutamic acid hydrolytic solution (B)

由圖14可以看出，γ-PGA水解產(chǎn)物只有一種氨基酸，并且與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間基本相同，初步證明了γ-PGA為谷氨酸的一種聚合物，水解樣與標(biāo)準(zhǔn)樣比對(duì)基本一致。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化確定Bacillus nattoTK-2發(fā)酵產(chǎn)γ-PGA的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖2.5%，蛋白胨2.5%，味精2%，pH7.5；最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：裝液量70mL/250mL，接種量2%，培養(yǎng)溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速140 r/min；在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，γ-PGA產(chǎn)量為11.48 g/L，產(chǎn)量提高了57.2%。

采用HPLC測(cè)定分析，γ-PGA是谷氨酸的一種聚合物，其水解產(chǎn)物只有一種氨基酸，并且與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時(shí)間基本相同。本研究成果為γ-PGA的綜合開發(fā)利用提供理論支撐依據(jù)。