利用紙層析-分光光度法檢測甲基營養菌5222產L-絲氨酸

張建云，谷立坤，崔芽芽，韓夢霞，彭 更，史永勝

（1.河南工程學院 資源與環境學院，河南 鄭州 451191；2.河南工程學院 煤化工資源綜合利用與污染治理河南省工程實驗室，河南 鄭州 451191）

L-絲氨酸（L-serine）化學結構為HO-CH2CH（NH3）-COOH，分子質量為105.10，化學名為α-氨基-β-羥基丙酸，是一種含羥基的中性氨基酸[1]。L-絲氨酸雖屬人體非必需氨基酸，但卻具有許多重要的生理功能，在醫藥、食品、化妝品等領域均有廣泛應用，市場需求量日益增高[2]。目前，國內外生產L-絲氨酸的方法主要有發酵法[3]、酶轉化法[4]、提取法[5]和化學合成法等[6]。其中，發酵法生產L-絲氨酸的方法是微生物利用培養基中的營養物質直接產生L-絲氨酸。發酵法生產L-絲氨酸的菌株幾乎都是細菌，且產量不高，這是由于L-絲氨酸處于代謝的中間階段，代謝速率非常快，不易積累。酶轉化法是微生物培養到一定程度后，將產物的前體物質加入到培養基中，在微生物酶的作用下，生成L-絲氨酸。甘油酸、甘氨酸均可作為發酵前體物[7]。

目前，可以用來檢測L-絲氨酸含量的方法有高效液相色譜法[8]、氨基酸自動分析儀[9]、紙層析-分光光度法[10]、變色酸-分光光度法[11-12]、茚三酮顯色法[13-14]等。前兩種方法對儀器設備要求高、衍生步驟繁瑣，操作不方便，對于樣品多，工作量大的絲氨酸的分離及絲氨酸生產菌的篩選并不適合。茚三酮顯色法是利用絲氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱生成紫紅色縮合物質，其縮合物的顏色隨絲氨酸含量的變化而有所不同進行檢測，但該方法顯色的靈敏度比較差，不適合用常規的分光光度計進行檢測，只能使用專門針對低含量樣品設計的722E型可見分光光度計[15]。紙層析分光光度法和變色酸分光光度法操作簡單，成本低，顯色的靈敏度高，在常規的分光光度計上即可檢測，適用范圍較為廣泛。

甲基營養菌（Methylobacteriumsp.）指的能夠利用甲基化合物（甲烷、甲醛、甲醇、甲酸、甲基胺類等）為其唯一的碳源和能源進行生長的一類微生物。據估計，每年大概有83～273百萬噸甲醇，600百萬噸甲烷釋放到大氣中，此外，甲基胺類也廣泛存在于海洋和淡水環境中[16]。由于甲基營養型微生物能夠將自然界取之不盡、用之不竭的一碳化合物變為碳源和能源，可以解決發酵過程中糖原料的限制并且拓石化原料的應用范圍（我國年產甲醇5 000萬t，主要以煤制甲醇為主，國內甲醇的需求量為2 000萬t每年，產能過剩[17]），因此，對甲基營養型微生物的代謝研究具有重大意義。

絲氨酸是甲基營養型微生物的一種重要代謝產物。大部分能夠利用甲醇的甲基營養型細菌具有L-絲氨酸代謝途徑[18-19]，它們可以通過絲氨酸羥甲基轉移酶（serine hydroxymethyl transferase，SHMT）來同化單碳化合物與甘氨酸生產L-絲氨酸[20-21]。本實驗室篩選了多株能夠以甲醇為碳源的甲基營養型細菌，為了檢測它們是否能產L-絲氨酸以及產L-絲氨酸的水平，亟需建立一種準確、簡便的測定L-絲氨酸含量的方法。由于甲基營養菌主要通過轉化發酵液中的底物甘氨酸來生成L-絲氨酸，還需要檢測發酵液中甘氨酸的殘留情況來確定菌株對甘氨酸的轉化能力，而紙層析分光光度法能夠同時檢測出甘氨酸和L-絲氨酸的含量來反映菌株對底物的轉化情況。由于轉化體系與發酵液組分的差異，一些常用的氨基酸層析展開劑并不適合L-絲氨酸和甘氨酸的分離和含量測定。由此，本研究通過優化層展劑的種類、洗脫溫度、洗脫時間等因素，建立一種L-絲氨酸檢測方法，通過對該檢測方法的精密度、準確性、穩定性等方法學考察，最終確定該方法的最佳實驗條件，并用于檢測和評價本實驗室篩選的甲基營養型細菌產L-絲氨酸的能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實驗中所用的菌種均來自課題組保藏菌種，所用菌株為甲基營養型細菌（Methylobacteriumsp.）5222。

1.1.2 化學試劑

甘氨酸（純度＞99.0%）、L-絲氨酸（純度＞99.0%）：美國Amresco公司；茚三酮（分析純）：西隴化工股份有限公司；丙酮、正丁醇、二乙胺（均為分析純）：天津致遠化學試劑有限公司；硫酸銅、乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

無機鹽液體培養基：磷酸氫二鉀7.5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，無水氯化鈣0.015 g/L，氯化鈉0.5g/L，硫酸銨2g/L，加蒸餾水1L。121℃高壓蒸汽滅菌20min。

接菌前加入過濾除菌后的甲醇達到0.7%（V/V）為宜。

1.2 儀器與設備

PHS-25B型數字酸度計：上海大普儀器有限公司；752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：上海藍豹實驗儀器有限公司；HC-2064高速臺式離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；LDZM-60KCS-II立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；FA2204B電子天平：上海天美天平儀器有限公司；LRH-150生化培養箱、THZ-300臺式恒溫搖床：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液及發酵液的制備方法

甲基營養型細菌種子液的制備：從平板上挑取單菌落于0.7%甲醇（V/V）裝液量為5 mL/25 mL無機鹽液體培養基中，于34 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養48 h，終止發酵，即得種子培養液。

甲基營養型細菌發酵液的制備：將1%甲基營養型細菌種子液接種于含0.7%甲醇（V/V）裝液量為50 mL/300 mL無機鹽液體培養基中，于34 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養48 h，然后在無菌條件下加入過濾除菌的甘氨酸母液至終質量濃度為5 g/L，繼續培養48 h，終止發酵即得發酵液。

1.3.2 紙層析-分光光度法測定氨基酸含量

（1）主要試劑和溶液的配制

展開劑：①正丁醇∶丁酮∶濃氨水∶水=4∶3∶2∶1（V/V）、②丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶10∶2∶5（V/V）、③正丁醇∶乙酸∶水=12∶3∶5（V/V）、④乙醇∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶15∶5∶8（V/V）；顯色劑：稱取0.5 g茚三酮溶于100 mL丙酮中；洗脫液：0.1%硫酸銅∶體積分數為75%乙醇=2∶38（V/V）。現配現用。

10 g/LL-絲氨酸標準液的配制：稱取1.0 gL-絲氨酸溶解于蒸餾水并定容至100 mL；10 g/L甘氨酸標準液的配制：稱取1.0 g甘氨酸溶解于蒸餾水并定容至100 mL；100 g/L甘氨酸母液的配制：稱取10.0 g甘氨酸溶解于蒸餾水并定容至100 mL。

（2）紙層析-分光光度法測定

點樣：將濾紙裁成9 cm×28 cm大小，用鉛筆在距濾紙底端2 cm的地方劃一道基線，在線上每隔2 cm，畫上一個小點作為點樣原點。將待測氨基酸樣品點樣于濾紙上所標點的中心位置，點樣量為0.2～2.0 μL（樣品中氨基酸的含量為5～20 μg為宜）。

層析、顯色：展開劑于層析缸中密封靜置，待所點樣液風干后，將濾紙放于層析杠中，并密封缸口。待層析液上行展開至距濾紙頂端1.0 cm左右時，取出層析紙后吹風機吹干，將顯色劑用噴霧器均勻噴灑于層析紙上，置于烘箱中105 ℃顯色5 min，取出。

比移值（retardation factor，Rf）為斑點中心距原點的距離與溶劑展開前沿距原點距離的比值，其計算公式如下：

Rf值=斑點中心移動距離/溶劑前沿移動距離

洗脫：待斑點完全顯出后，剪下氨基酸斑點置于具塞玻璃管中，用5.0 mL洗脫液靜置洗脫30 min后，得洗脫液。并在752N紫外可見分光光度計上測定其吸光度值。

（3）L-絲氨酸的標準曲線的繪制

將L-絲氨酸標準溶液點樣于濾紙上所標點的中心位置，點樣量依次為0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL、1.2 μL，層析、顯色并洗脫后于波長510 nm處測定其吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，以L-絲氨酸質量（x）為橫坐標繪制L-絲氨酸標準曲線。甘氨酸標準曲線制作同上。

（4）發酵液中氨基酸含量的測定

將發酵液在8 000 r/min轉速下離心5 min，取出上清液，點樣2.0 μL于層析濾紙上展開、顯色。根據L-絲氨酸和甘氨酸標準樣展開的Rf值定性判斷發酵液中是否含有這兩種氨基酸，若含有L-絲氨酸和甘氨酸，再剪下顯色斑點洗脫，測定吸光度值，根據L-絲氨酸和甘氨酸的標準曲線方程算出發酵液中L-絲氨酸和甘氨酸含量。

1.3.3 紙層析-分光光度法精確性和準確性測試

通過對該方法進行精密度實驗和回收率實驗來確定方法的精確性和準確度。

2 結果與分析

2.1 展開劑的選擇

為了使L-絲氨酸和甘氨酸兩種氨基酸成功分離，各自單獨獲得，將L-絲氨酸、甘氨酸的標準液及L-絲氨酸和甘氨酸標準溶液的混合液采用1.3.2 中4種不同的展開劑液分別進行紙層析實驗，以獲取最佳的展開劑，紙層析結果見圖1。

圖1 發酵液在不同展開劑條件下的紙層析色譜圖Fig.1 Paper chromatogram of fermentation broth under different developing solvents

由圖1可知，采用③和④作為展開劑時，L-絲氨酸和甘氨酸斑點間的Rf值基本一致（用③作展開劑二者的Rf值均為0.295，用④作展開劑二者的Rf值分別為0.23和0.24），混合液中L-絲氨酸和甘氨酸未出現分離現象，因此不能作為本實驗的展開劑。采用①作展開劑分離時，兩種氨基酸的Rf值差距不明顯（Rf值分別為0.175和0.12），僅僅能證明混合液中有兩種氨基酸的存在，但分離效果不好。采用②作為展開劑時能夠明顯分離出混合液中的L-絲氨酸和甘氨酸，并且L-絲氨酸和甘氨酸斑點間Rf值差距較大（Rf值分別為0.445和0.295），效果最佳。因此，選擇丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶10∶2∶5（V/V）作為最佳展開劑。

2.2 洗脫液最佳波長的測定

L-絲氨酸及甘氨酸的點樣量為2.0 μL，展開、顯色顯出斑點后，剪下斑點在具塞玻璃管中用5 mL洗脫液洗脫30 min左右。以空白洗脫液為對照，用分光光度計在不同波長條件下測定洗脫液的吸光度值，確定洗脫液的最佳波長，結果見圖2。

圖2 洗脫液中L-絲氨酸和甘氨酸最適波長的測定Fig.2 Determination of optimal wavelength of L-serine and glycine in eluants

由圖2可知，L-絲氨酸的最大吸收波長為510 nm，甘氨酸的最大吸收波長也為510 nm。結果表明，當波長為510 nm時，兩種氨基酸分析吸收峰均處于波峰位置，即兩種洗脫液的吸光度值均達到最大值。因此，在測定L-絲氨酸和甘氨酸吸光度值時，均在510 nm波長條件下測定。

2.3 展開劑最佳pH值測定

按照最佳展開劑②比例配成展開劑的初始pH值為12.7，然后用2 mol/L的鹽酸溶液將展開劑pH值依次調為10.5、8.0、6.0、4.0、2.0，用2.5 μL移液槍分別取0.5 μLL-絲氨酸、甘氨酸、L-絲氨酸和甘氨酸混合標準液點樣，分別進行層析、顯色，最終紙層析顯色結果見圖3。

圖3 不同pH條件下標準液的紙層析色譜圖Fig.3 Paper chromatogram of standard liquid under different pH conditions

由圖3可知，當展開劑pH值近似為8.0和2.0時基本不顯出斑點；而當pH值為12.7時，能達到較好的層析效果，L-絲氨酸和甘氨酸混合液分離明顯。因此，層析液按照各試劑比例配好后無需調pH值即能達到最佳的分離效果，可直接作為展開劑使用。

2.4 洗脫液最佳洗脫時間測定

L-絲氨酸的點樣量為2.0 μL，展開、顯色顯出斑點后，在具塞玻璃管中用10 mL洗脫液洗脫不同時間。以空白洗脫液為對照，用分光光度計在波長510 nm處測定洗脫液的吸光度值，結果見圖4。

圖4 洗脫時間與吸光度值的關系Fig.4 Relationship between elution time and absorbance value

由圖4可知，在波長510 nm處洗脫液洗脫30 min時的吸光度值最大，因此測定L-絲氨酸和甘氨酸時，均選用30 min作為最佳洗脫時間。

2.5 洗脫液穩定性測定

L-絲氨酸的點樣量為2.0 μL，展開、顯色、顯出斑點后，剪下顯色斑點于具塞玻璃管中用10 mL洗脫液洗脫30 min后。放置不同時間后，以空白洗脫液為對照，用分光光度計在波長510 nm處測定洗脫液的吸光度值，結果見圖5。

圖5 洗脫后放置不同時間與吸光度值的關系Fig.5 Relationship between eluent preserving time and absorbance value

由圖5可知，隨著洗脫后洗脫液放置時間的延長，洗脫液的吸光度值在不同程度上會有所降低。結果表明，在洗脫工作完成后要盡快測定洗脫液的吸光度值，不要間隔太長時間，盡量在10 min內完成所有測量工作，從而達到減小誤差的目的。

2.6 L-絲氨酸及甘氨酸標準曲線的繪制

L-絲氨酸及甘氨酸的點樣量分別依次為2.0 μg、4.0 μg、6.0 μg、8.0 μg、10.0 μg、12.0 μg，待L-絲氨酸加甘氨酸標準液點樣、展開、顯色后，剪下顯色斑點置于具塞玻璃管中用5 mL洗脫液洗脫30 min，顯色后圖譜斑點進行洗脫。以空白洗脫液為對照，用分光光度計在波長510 nm處測定洗脫液的吸光度值，以吸光度值（y）為縱坐標，以L-絲氨酸及甘氨酸質量（x）為橫坐標繪制L-絲氨酸及甘氨酸標準曲線，結果見圖6。

圖6 L-絲氨酸（A）及甘氨酸（B）標準曲線Fig.6 Standard curves of L-serine (A) and glycine (B)

由圖6A可知，L-絲氨酸標準曲線回歸方程為y=0.008 8x+0.008 9，相關系數R2=0.996 2。由圖6B可知，甘氨酸回歸方程為y=0.016 2x+0.040 5，相關系數R2=0.995 5。結果表明，L-絲氨酸和甘氨酸質量與吸光度值之間線性關系良好。

2.7 精密度實驗

對10.0 μgL-絲氨酸分別進行5次平行實驗。點樣、展開、顯色，洗脫后測量吸光度值，根據L-絲氨酸標準曲線方程算出L-絲氨酸含量，結果見表1。由表1可知，經計算得到L-絲氨酸的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為2.3%。結果表明，該方法具有良好的精密度。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision tests

2.8 加標回收率實驗

為了檢驗該方法在發酵液中的準確性，點樣2 μL處理過的發酵液，同時加入0.5 μLL-絲氨酸標準溶液，并另外點2 μL發酵液來測定發酵液中的絲氨酸含量，進行加標回收率實驗，結果見表2。

表2 加標回收率實驗結果Table 2 Results of standard recovery rate tests

由表2可知，發酵液中L-絲氨酸的加標回收率在91%～98%之間，RSD為2.6%，說明該方法在發酵液中受到的干擾比較小。

2.9 甲基營養菌5222發酵液中L-絲氨酸含量的測定結果

取培養96 h的發酵液上清2 μL，通過層展、顯色、洗脫等步驟測定甲基營養菌5222發酵液中L-絲氨酸的含量，結果見表3。由表3可知，發酵液中L-絲氨酸的含量為0.90 g/L。

表3 發酵液中L-絲氨酸含量的測定結果Table 3 Determination results of L-serine content in fermentation broth

3 結論

紙層析-分光光度法所用儀器設備比較簡單，操作方便，重復性好。在發酵液中測定時，沒有受到明顯干擾，測定結果準確可靠，可以用于發酵培養基中L-絲氨酸含量的測定。本研究確立了紙層析-分光光度法的最適工作條件：展開劑為丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水=10∶10∶2∶5（V/V），展開劑pH值為12.7，波長為510 nm，洗脫時間為30 min。應用此方法，可以檢測到甲基營養型細菌5222在發酵培養96 h以后，發酵液中L-絲氨酸的含量為0.90 g/L。