遮光處理對(duì)赤霞珠非花色苷酚組分及含量的影響

閆 雪，李 倩，王 瑞，喬 丹，張 軻，王 晶，王文璇，張珍珍*

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000）

非花色苷酚是葡萄中的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)葡萄酒的苦澀味、色澤、貯藏壽命及生物化學(xué)穩(wěn)定性都具有重要作用[1]，并通過(guò)輔助成色的作用，可與花色苷一起決定葡萄酒的顏色[2]；研究表明，多酚主要分布于葡萄皮、種子和果梗中，其中果皮是多酚分布種類最多的部位，占葡萄漿果總質(zhì)量的8%左右[3]。在葡萄成熟過(guò)程中非花色苷酚的變化極其復(fù)雜，其含量受到葡萄品種、土壤環(huán)境、整形方式以及遮光處理等因素的影響[4-7]。葡萄屬于喜光植物，對(duì)光照具有較高要求，在葡萄生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)光照反應(yīng)敏感[8]，光照充足果實(shí)品質(zhì)提高、風(fēng)味突出協(xié)調(diào)；光照不足引起光合效率降低、果實(shí)上色水平降低、果實(shí)品質(zhì)下降[9]；但炎熱的氣候和過(guò)強(qiáng)的光照對(duì)葡萄有傷害[10]；倪志婧等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，采用遮光率為40%遮陽(yáng)網(wǎng)的處理總酚質(zhì)量比最高；也有研究證實(shí)[12]，光照條件的不同還會(huì)引起類黃酮代謝產(chǎn)物的比例發(fā)生變化。另外，在果實(shí)不同發(fā)育階段進(jìn)行光照或遮光處理，對(duì)果實(shí)酚類含量的影響不同。這表明葡萄果實(shí)類黃酮代謝對(duì)光響應(yīng)具有發(fā)育階段的依賴性[13]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于非花色苷酚類物質(zhì)研究的報(bào)道還比較少，大部分都集中在花色苷酚類。

新疆長(zhǎng)期以來(lái)就是我國(guó)最主要的葡萄生產(chǎn)地，近年來(lái)葡萄種植面積也在不斷擴(kuò)大，但葡萄與葡萄酒質(zhì)量及風(fēng)格同質(zhì)化現(xiàn)象仍較為嚴(yán)重[14]。對(duì)于釀造葡萄而言，葡萄質(zhì)量決定了葡萄酒的先天品質(zhì)，而對(duì)葡萄質(zhì)量的要求主要體現(xiàn)在果實(shí)糖度、糖酸比例和內(nèi)涵組分上[15]。糖度、糖酸比例是判斷葡萄成熟的基本指標(biāo)，而葡萄的內(nèi)涵組分是構(gòu)成葡萄酒多樣性的重要因素，只有了解葡萄中的組分構(gòu)成，才能針對(duì)性的改進(jìn)工藝，提高葡萄酒的品質(zhì)[16]，目前針對(duì)新疆產(chǎn)區(qū)所處的地理環(huán)境及葡萄酒所面臨的問(wèn)題，有關(guān)遮光處理對(duì)葡萄非花色苷酚積累影響的研究較少，因此，研究非花色苷酚在葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中的組成特征及變化有利于從非花色苷酚的角度了解葡萄及葡萄酒中的品種特色及產(chǎn)地風(fēng)格。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在不同時(shí)期對(duì)釀酒葡萄進(jìn)行不同遮光處理，以探究光照強(qiáng)度在不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)葡萄果實(shí)非花色苷酚積累的影響，為提高葡萄果實(shí)的質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)選取新疆昌吉州榆樹(shù)溝鎮(zhèn)遺韻酒莊種植基地釀酒葡萄赤霞珠為試材，所摘葡萄果實(shí)均果粒飽滿，大小均勻，采摘時(shí)兼顧陰、陽(yáng)兩面和上、中、下果穗及每穗果實(shí)的頂、中、尾部。隨機(jī)選取350粒果實(shí)，放置于裝有冰袋的泡沫箱中運(yùn)回。每組樣品隨機(jī)選取50～70粒果實(shí)用于理化指標(biāo)測(cè)定，其它用液氮迅速冷凍，并放于-80 ℃冰箱中保存，用作其他檢測(cè)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同程度的遮光處理，采用兩種黑色遮陽(yáng)網(wǎng)為材料：網(wǎng)1遮光率為50%，網(wǎng)2遮光率為20%。甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（均為色譜純）：美國(guó)Fisher公司；乙酸乙酯（分析純）：北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)：上海比郎儀器制造公司；HZSH型水浴振蕩器：上海思蘭達(dá)科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海星宋科學(xué)儀器有限公司；HPLC-MS 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Fisher公司；PAL-2手持糖度計(jì)：日本ATAGO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 遮光處理

分別于果實(shí)達(dá)到5%轉(zhuǎn)色（花后9周）至完全成熟、100%轉(zhuǎn)色（花后13周）至完全成熟兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)水泥柱和鐵絲在樹(shù)體頂端搭建網(wǎng)1及網(wǎng)2進(jìn)行不同遮光處理，以不搭設(shè)遮陽(yáng)網(wǎng)的植株為對(duì)照，搭網(wǎng)后一周（即花后10周、花后14周），以及葡萄果實(shí)完全成熟達(dá)到采收期時(shí)進(jìn)行樣品采集，每個(gè)處理設(shè)有3個(gè)生物學(xué)平行。在采收期時(shí)，空白樣品采摘于9月24日，經(jīng)過(guò)Q1、Q2處理的果實(shí)采摘于10月4日，經(jīng)過(guò)H1、H2處理的果實(shí)采摘與9月24日，由此可看出在5%轉(zhuǎn)色-完全成熟時(shí)期搭建遮光網(wǎng)可延緩果實(shí)成熟8～10 d。本實(shí)驗(yàn)中5種處理分別為CK：不遮光，果實(shí)正常生長(zhǎng)（空白對(duì)照）；Q1：5%轉(zhuǎn)色至完全成熟期間采用網(wǎng)1遮光；Q2：5%轉(zhuǎn)色至完全成熟期間采用網(wǎng)2遮光；H1：100%轉(zhuǎn)色至完全成熟期間采用網(wǎng)1遮光；H2：100%轉(zhuǎn)色至完全成熟期間采用網(wǎng)2遮光。

1.3.2 果實(shí)理化指標(biāo)檢測(cè)

可溶性固形物用手持式糖度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，可滴定酸含量采用酸堿滴定法（以酒石酸計(jì)）進(jìn)行測(cè)定，每組樣品做2個(gè)平行。

1.3.3 非花色苷酚測(cè)定方法

葡萄皮中非花色苷酚的提取和定量[17]：葡萄果實(shí)經(jīng)人工剝皮，液氮處理果皮后研磨成粉冷凍干燥。冷凍干燥后稱取2 g干粉于離心管中，加入2 mL水及18 mL乙酸乙酯，搖床振蕩30 min后，倒出上清液（重復(fù)此操作5次），上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用色譜級(jí)甲醇定容至5 mL，提取液放入-80 ℃冰箱中保存。

葡萄果實(shí)中非花色苷酚的檢測(cè)和定性參考李斯嶼等[18]的方法，采用高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatogram-mass spectrum，HPLC-MS）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平P＜0.05；通過(guò)繪圖軟件Origin Pro 8.5進(jìn)行繪圖。采用MetaboAnalyst進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 果際微氣候監(jiān)測(cè)

圖1 遮光對(duì)果際微氣候的影響Fig.1 Effect of shading on grape fruit micro-climate

實(shí)驗(yàn)期間，在對(duì)照及兩種遮陽(yáng)網(wǎng)的果穗附近分別架設(shè)微型氣象站（HOBO H21-002，Onset Corporation，USA），跟蹤不同遮光處理以及對(duì)照之間果際周圍光合有效輻射（photo synthetically active radiation）、太陽(yáng)總輻射（solar radiation）、大氣溫度（daily berry temperature）和相對(duì)濕度（relative humidity）的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，遮光后果際周圍的光合有效輻射及太陽(yáng)總輻射均低于對(duì)照，其中網(wǎng)1條件下的太陽(yáng)光合有效輻射減少了大約50%，而網(wǎng)2太陽(yáng)光合有效輻射減少了大約20%，遮陽(yáng)網(wǎng)在有效遮光的同時(shí)，對(duì)果際周圍的溫度和相對(duì)濕度無(wú)顯著影響。同時(shí)于5%轉(zhuǎn)色至完全成熟時(shí)進(jìn)行遮光處理可以推遲果實(shí)成熟8～10 d。

2.2 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

表1 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)可溶性固形物和可滴定酸含量的影響Table 1 Effects of shading treatments on soluble solids and titratable acid content of grape fruit

由表1可知，葡萄果實(shí)在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，可溶性固形物含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)?？扇苄怨绦挝锖吭诨ê?0周至花后14周迅速增長(zhǎng)，在花后14周至完全成熟時(shí)期增長(zhǎng)較為緩慢。在葡萄果實(shí)100%轉(zhuǎn)色至完全成熟搭建遮陽(yáng)網(wǎng)相較于葡萄果實(shí)5%轉(zhuǎn)色至完全成熟搭建遮陽(yáng)網(wǎng)可溶性固形物含量高，經(jīng)過(guò)遮光處理的葡萄果實(shí)在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可溶性固形物含量均低于對(duì)照組。同時(shí)葡萄果實(shí)可滴定酸含量在所選三個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在5%轉(zhuǎn)色至100%轉(zhuǎn)色時(shí)迅速下降，降低了76.66%，在完全轉(zhuǎn)色至成熟時(shí)期，可滴定酸含量逐漸緩慢下降。經(jīng)過(guò)遮光處理的葡萄果實(shí)在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中可滴定酸含量相較于對(duì)照組無(wú)明顯差異。

2.3 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)非花色苷酚總量的影響

非花色苷酚類是葡萄果實(shí)中除花色苷酚外的一類酚類物質(zhì)，主要包括酚酸類（苯甲酸類、肉桂酸類）、黃酮醇類（黃烷酮類、黃酮醇類、黃酮類）、黃烷醇類以及芪類等[19]，具有增加顏色強(qiáng)度和穩(wěn)定顏色的輔色作用[20]，對(duì)于葡萄的質(zhì)量有重要意義。其能產(chǎn)生收斂性和苦味，影響葡萄酒的口感[21]。2016年從昌吉遺韻赤霞珠果皮中共檢測(cè)17種非花色苷酚，且遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)中的非花色苷酚的構(gòu)成種類不會(huì)有影響。如圖2所示，在花后14周時(shí)，4種遮光處理的果實(shí)中非花色苷酚含量均高于對(duì)照組，其中經(jīng)過(guò)Q1、Q2、H1、H2處理的葡萄果實(shí)非花色苷酚含量分別為1.14 mg/g、1.43 mg/g、1.39 mg/g、1.82 mg/g。在果實(shí)達(dá)到采收期時(shí)，Q1、Q2、H2處理的葡萄果實(shí)非花色苷酚含量顯著高于CK，分別提升了18.63%、11.80%、11.80%。同時(shí)上述結(jié)果表明，遮光處理可顯著影響葡萄果實(shí)中非花色苷酚的積累（P＜0.05）。

圖2 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)非花色苷酚總量的影響Fig.2 Effect of shading treatments on the content of non-anthocyanin phenols in grape fruit

2.4 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)黃烷-3-醇類化合物含量的影響

黃烷-3-醇類化合物的單體是為葡萄酒提供苦味和收斂性的重要物質(zhì)，主要存在于種子中[22]，具有抗氧化作用，降低血壓的功效[23]。前人研究表明，兒茶素是黃烷-3-醇類化合物的主要來(lái)源[4]，這與本實(shí)驗(yàn)所得研究結(jié)果一致。不同遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)中黃烷-3-醇類化合物含量的影響見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)不同的遮光處理，對(duì)葡萄果實(shí)中的黃烷-3-醇類化合物含量影響結(jié)果不同，在所檢測(cè)的葡萄果實(shí)中，共檢測(cè)出4種黃烷醇類物質(zhì)，分別為原花青素B1、沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、原花青素B2。在所選擇的葡萄果實(shí)生長(zhǎng)周期內(nèi)，黃烷-3-醇類物質(zhì)整體呈現(xiàn)在花后14周時(shí)上升，在完全成熟時(shí)下降的趨勢(shì)。在花后4周時(shí)，采取Q1處理的黃烷-3-醇類物質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），含量可達(dá)到0.41 mg/g，增長(zhǎng)了1.5倍。其他處理無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在葡萄果實(shí)達(dá)到完全成熟時(shí)，Q1、Q2、H1、H2處理后黃烷-3-醇類化合物含量分別可達(dá)到0.33 mg/g、0.17 mg/g、0.21 mg/g、0.20 mg/g。相比于CK有了顯著的提升（P＜0.05）。在葡萄生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中采用遮光處理有利于在果實(shí)成熟時(shí)提高黃烷-3-醇類物質(zhì)含量。

圖3 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)黃烷-3-醇類化合物含量的影響Fig.3 Effects of shading treatments on the content of flavan-3-alcohol in grape fruit

2.5 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)黃酮醇類化合物含量的影響

對(duì)于紅色釀酒品種來(lái)說(shuō)，果皮中含有大量的黃酮醇類物質(zhì)[24]，具有保護(hù)葡萄免受紫外線的傷害、消除自由基的功能。圖4顯示了黃酮醇經(jīng)過(guò)4種遮光處理與對(duì)照在所選生長(zhǎng)時(shí)期的含量變化，黃酮醇類物質(zhì)含量的變化與本試驗(yàn)可檢測(cè)到非花色苷酚總量的變化規(guī)律相似，這與姜壽梅等[25]在西拉葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的研究結(jié)果相似，可看出黃酮類物質(zhì)是葡萄果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育中最主要的非花色苷酚，其含量高低直接影響總非花色苷酚的變化趨勢(shì)，黃酮醇物質(zhì)在所檢測(cè)的葡萄果實(shí)中共檢出3類，包括楊梅酮類物質(zhì)、槲皮素類物質(zhì)、山萘酚類物質(zhì)。黃酮醇類物質(zhì)的含量在花后的不同時(shí)期中呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，在花后14周時(shí)，4種遮光處理中，Q2、H1、H2三種處理有提升黃酮醇含量的效果，處理后黃酮醇含量可達(dá)到1.24 mg/g、1.20 mg/g、1.66 mg/g。在果實(shí)完全成熟達(dá)到采收時(shí)期，H1處理會(huì)抑制黃酮醇類物質(zhì)的積累。

圖4 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)黃酮醇類化合物含量的影響Fig.4 Effects of shading treatments on the content of flavonols in grape fruit

2.6 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)中楊梅酮類化合物含量的影響

圖5 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)楊梅酮類化合物含量的影響Fig.5 Effects of shading treatments on the content of myricetin in grape fruit

為了探究不同遮光處理對(duì)黃酮醇類物質(zhì)里各組分的影響，對(duì)楊梅酮類、槲皮素類及山萘酚類分別進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楊梅酮類物質(zhì)在果實(shí)5%轉(zhuǎn)色至完全成熟采收時(shí)期總體呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，在花后14周時(shí)，Q1、Q2、H1、H2處理均提升了楊酶酮類物質(zhì)的含量積累，其中未經(jīng)任何處理的果實(shí)楊酶酮含量為0.02 mg/g，經(jīng)過(guò)處理后含量可達(dá)到0.06 mg/g、0.30 mg/g、0.34 mg/g、0.40 mg/g，其中，H2處理顯著提升了楊梅酮類物質(zhì)含量的積累（P＜0.05）。

2.7 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)中槲皮素類化合物含量的影響

槲皮素類物質(zhì)是非花色苷酚類物質(zhì)中的一大類物質(zhì)[26]，占非花色苷酚的60%以上，在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在花后14周時(shí)，Q2、H1、H2三種處理均可顯著提高槲皮素含量（P＜0.05），槲皮素含量為0.86 mg/g、0.79 mg/g、1.11 mg/g，相較與CK含量0.64 mg/g提升了34.37%、23.43%、73.43%，當(dāng)果實(shí)完全成熟時(shí)，H1處理會(huì)抑制槲皮素類物質(zhì)的積累。

圖6 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)槲皮素類化合物含量的影響Fig.6 Effect of shading treatments on quercetin content in grape fruit

2.8 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)中山萘酚類化合物含量的影響

山萘酚類物質(zhì)整體呈現(xiàn)緩慢先降后升趨勢(shì)，在花后14周時(shí)，Q2、H2 2種遮光處理的山萘酚含量顯著高于CK（P＜0.05），其中H2處理增長(zhǎng)幅度較大，Q2處理次之。在葡萄果實(shí)完全成熟時(shí)期，Q1、Q2、H1、H2 4種遮光處理對(duì)于黃酮醇類中的3類物質(zhì)積累并無(wú)顯著影響（P＞0.05）。綜上所述，不同時(shí)期的不同遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)中的3類黃酮醇類物質(zhì)均有顯著影響，并且在完全轉(zhuǎn)色時(shí)影響較大。同時(shí)，選取遮光率20%的遮陽(yáng)網(wǎng)（網(wǎng)2）處理效果更加顯著。

圖7 遮光處理對(duì)葡萄果實(shí)山萘酚類化合物含量的影響Fig.7 Effect of shading treatments on the content of kaempferol in grape fruit

2.9 遮光處理對(duì)非花色苷酚組分構(gòu)成的影響

通過(guò)偏最小二乘法（PLS-DA）更直觀表明不同處理之間非花色苷酚濃度之間的差異，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 PLS-DA分析不同遮光處理對(duì)非花色苷酚組分的影響Fig.8 Analysis of the effects of different shading treatments on non-anthocyanin phenols components by PLS-DA

由圖8可知，CK處理與其他遮光處理在圖中明顯分開(kāi)，說(shuō)明不同遮光處理方式對(duì)非花色苷酚的積累均有影響。4種不同遮光處理的樣品均分布在X軸正半軸，對(duì)照樣品分布在X軸負(fù)半軸。由圖8A、8B可以看出，Q1、Q2處理可提升沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin）、原花青素B1（procyanin B1）、兒茶素（catechin）、楊梅酮（myricetin）、槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-galactoside）類物質(zhì)的含量，同時(shí)抑制了槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸（quercetin-glucuronide）的含量。圖8C、8D展示了H1、H2處理對(duì)沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin）、兒茶素（catechin）、原花青素B1（procyanin B1）、原花青素B2（procyanin B2）有提升效果，同時(shí)會(huì)抑制槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-galactoside）、楊梅酮-3-O-葡萄糖苷（myricetinglucoside）、楊梅酮-3-O-半乳糖苷（myricetin-galactoside）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-glucoside）的積累。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)4種遮光處理葡萄果實(shí)的可溶性固形物含量低于對(duì)照組，且經(jīng)過(guò)遮光處理的葡萄果實(shí)上調(diào)了非花色苷酚的積累。在本實(shí)驗(yàn)中，Q1、Q2、H2三種處理均可顯著提高非花色苷酚的積累。4種不同遮光處理對(duì)黃烷-3-醇類化合物的影響主要集中在葡萄果實(shí)完全成熟時(shí)期，而相對(duì)于黃酮醇來(lái)說(shuō)，花后14周時(shí)，4種遮光處理影響了葡萄果實(shí)非花色苷酚的積累。運(yùn)用PLS-DA分析可得到，Q1、Q2處理可提升沒(méi)食子兒茶素、原花青素B1、兒茶素、楊梅酮、槲皮素-3-O-半乳糖苷類物質(zhì)的含量，同時(shí)抑制了槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的含量。H1、H2處理則對(duì)沒(méi)食子兒茶素、兒茶素、原花青素B1、原花青素B2有提升效果，同時(shí)會(huì)抑制槲皮素-3-O-半乳糖苷、楊梅酮-3-O-葡萄糖苷、楊梅酮-3-O-半乳糖苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的積累。