蠟樣芽孢桿菌產磷脂酶D發酵條件優化

代書玲，陳 國，宗 琪

（上海農林職業技術學院，上海 201600）

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是一類特殊的酯鍵水解酶，能催化水解磷脂分子中的磷酸和羥基化合物的羥基成酯的P-O鍵，水解產物為磷脂酸（phosphatidic acid，PA）和羥基化合物，如水解磷脂酰膽堿（phosphatidyl cholines，PC）生成PA和膽堿；在特定條件下，PLD還能催化PA轉移至其他的含羥基化合物（如絲氨酸、果糖等）形成新的酯鍵，也稱為轉磷脂酰基反應[1-3]。PLD催化的轉磷脂酰基反應有重要的應用價值，可以用于磷脂的定向改造、藥物的合成以及單一磷脂、稀有磷脂的制備[4-8]。PLD廣泛分布于細菌、真菌和動植物體中，相對于動植物來源的PLD，微生物來源的PLD具有更強的轉磷脂酰基能力，底物特異性低，受到國內外學者廣泛關注[9-13]。目前報道的產磷脂酶D的微生物主要有鏈霉菌屬、大腸桿菌、芽孢桿菌、假單胞菌、沙門氏菌、抗輻射不動桿菌等[14-16]，其中對產酶發酵條件進行深入研究的主要集中在鏈霉菌屬的微生物[17-19]，對細菌產PLD的研究主要集中在基因工程菌的構建，對從自然界中篩選的蠟樣芽孢桿菌產PLD發酵條件進行優化鮮有報道。為此，本研究對實驗室篩選到的蠟樣芽孢桿菌產磷脂酶D的發酵條件進行優化，為PLD的工業化生產和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）：實驗室篩選獲得。

卵黃LB固體培養基：在LB固體培養基中添加20g/L卵黃。

硼砂卵黃固體培養基：NaCl 6.6 g/L、硼酸10.9 g/L、硼砂1.9 g/L、瓊脂粉20 g/L、卵黃20 g/L，pH7.2～7.4。

基礎發酵培養基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉粉1 g/L、NaCl 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、CaCl21 g/L，pH值6.5～7.0，種子培養基同基礎發酵培養基。

磷脂酶D活性分析試劑盒（比色法）：美國Bio Vision公司；LB固體培養基、蛋白胨、牛肉粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：青島海博生物有限公司；十二烷硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）：國藥集團化學試劑有限公司；卵黃取自新鮮雞蛋，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LHS-250SC電熱恒溫恒濕培養箱、THZ-100B恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；Infinite 200 PRO多功能酶標儀：瑞士帝肯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵方法

取生長良好的斜面菌種1～2環，接種到種子培養基中，36 ℃、200 r/min搖瓶培養10 h得到種子液。取適量種子發酵液，按照一定的接種量接入發酵培養基中，在一定溫度、200 r/min條件下培養一定時間后，取樣測定發酵液中PLD的水解酶活力及菌體濃度。

1.3.2 粗酶液制備

將發酵液在4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液即為粗酶液。

1.3.3 磷脂酶D活力測定

硼砂卵黃平板牛津杯法測酶活[20]：取100 μL稀釋后的粗酶液置于等距放置在硼砂卵黃平板上的牛津杯中，36 ℃溫育24 h，所產生的乳白色暈圈的大小即代表酶活力的高低。為使結果具有可比性，硼砂卵黃平板采用同一規格的平皿，加入等量同批次硼砂卵黃固體培養基。為消除不同pH及酶濃度過高對暈圈反應的影響，粗酶液用一定pH緩沖液稀釋10倍作為暈圈反應測定液，每個樣品平行測定3次，取平均值。PLD水解活力測定采用酶聯比色法[21]：利用PLD水解磷脂酰膽堿產生膽堿，膽堿在膽堿氧化酶和過氧化物酶的作用下形成紅色顯色物質，在波長500 nm下有最大吸收峰。本研究使用市售的根據該原理制備的磷脂酶D活性分析試劑盒（比色法）測定粗酶液中PLD水解PC產生膽堿的水解酶活性，操作方法根據試劑盒使用說明書進行。酶活定義為在25 ℃、pH7.4條件下，以PC為底物，每分鐘生成1 μmol膽堿所需要的酶量為一個酶活力單位（U/mL）。由于該測定方法中膽堿氧化酶和過氧化物酶價格昂貴，故本研究中酶活初步鑒定采用硼砂卵黃平板牛津杯法。

1.3.4 菌體濃度測定

取發酵液1 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至100 mL，于波長660 nm處測定吸光度值，試驗過程中做3組平行試驗。

1.3.5 單因素試驗

在基礎發酵培養基基礎上，每次改變一個條件，研究不同碳源、氮源、表面活性劑、金屬離子、培養時間、溫度、初始pH及接種量對蠟樣芽孢桿菌產PLD的影響，根據硼砂卵黃平板牛津杯法產生的乳白色暈圈直徑大小鑒定酶活力的高低，每個因素做3個平行。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗基礎上，選取對酶活影響較大的因素，即卵黃、蛋白胨、牛肉粉、鎂離子質量濃度4個因素，采用4因素3水平設計正交試驗，進一步優化產酶條件，因素與水平見表1。

表1 培養基配方優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization

2 結果與分析

2.1 培養基成分對發酵產酶的影響

2.1.1 碳源種類及添加量對發酵產酶的影響

在基礎發酵培養基的基礎上，改變碳源種類，分別以10 g/L葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油、淀粉及卵黃為碳源，接種量2%，于36 ℃、200 r/min培養24 h，測定暈圈直徑，結果見圖1。由圖1可知，以10 g/L卵黃作為碳源產酶活力較高。

圖1 不同碳源種類對發酵產酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on enzyme production

以卵黃為碳源，改變卵黃添加量分別為10 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，培養基初始pH7.0，接種量為2%，于36 ℃、200 r/min培養24 h，測定暈圈直徑，結果見圖2。由圖2可知，卵黃添加量為20 g/L 時，發酵液中酶活力較好，繼續提高卵黃含量，酶活力下降，可能由于卵黃含量過高，培養基液體黏度過大，影響了微生物需氧。

圖2 卵黃添加量對發酵產酶的影響Fig.2 Effect of egg yolk addition on enzyme production

2.1.2 氮源種類及添加量對發酵產酶的影響

在基礎發酵培養基的基礎上，改變氮源種類，分別以10 g/L蛋白胨、10 g/L酵母膏、10 g/L牛肉粉、10 g/L硫酸銨及10 g/L蛋白胨與1 g/L酵母膏、10 g/L蛋白胨與1 g/L牛肉粉、10 g/L蛋白胨與1 g/L硫酸銨的復合為氮源進行試驗，發酵條件同碳源確定試驗，結果見圖3。由圖3可知，使用有機氮源效果比無機氮源好，有機氮源復合使用比單一使用效果好，其中，蛋白胨與牛肉粉復合使用效果較好。

圖3 不同氮源種類對發酵產酶的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on enzyme production

為進一步確定蛋白胨和牛肉粉復合使用的最適含量，固定牛肉粉添加量為1 g/L，改變蛋白胨的添加量分別為5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L進行試驗，結果如圖4a所示，隨著蛋白胨添加量增加，酶活性增加，添加量為15g/L時酶活性最高，繼續增加蛋白胨濃度，酶活反而下降，因此確定蛋白胨添加量為15 g/L。固定蛋白胨添加量為15 g/L，改變牛肉粉添加量分別為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、10 g/L進行試驗，結果如圖4b所示，結果表明，牛肉粉添加量為2g/L效果較好，繼續提高牛肉粉添加量至10 g/L，酶活增加不明顯，因此，確定牛肉粉添加量為2g/L。

圖4 氮源添加量對發酵產酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen source addition on enzyme production

2.1.3 無機鹽種類及添加量對發酵產酶的影響

以20 g/L卵黃、15 g/L蛋白胨、2 g/L牛肉粉、3 g/L NaCl為基礎培養基，改變無機鹽的種類，設置其含量均為1.5 g/L，培養基初始pH7.0，接種量為2%，于36 ℃、200 r/min培養24 h，測定暈圈直徑，結果見圖5。由圖5可知，添加1.5 g/L MgSO4·7H2O時發酵液中酶活力較好，而氯化鈷對該菌產PLD有強烈抑制作用，添加1.5 g/L氯化鈷時，發酵液中無酶活檢出。

圖5 不同無機鹽種類對發酵產酶的影響Fig.5 Effect of different inorganic salt on enzyme production

改變MgSO4·7H2O添加量分別為0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L進行試驗，結果見圖6。由圖6可知，MgSO4·7H2O添加量為2.0 g/L時，發酵液中酶活力較好。

圖6 無機鹽添加量對發酵產酶的影響Fig.6 Effect of MgSO4·7H2O concentration on enzyme production

2.1.4 表面活性劑及螯合劑對發酵產酶的影響

以20 g/L卵黃、15 g/L蛋白胨、2 g/L牛肉粉、3 g/L NaCl、2 g/L MgSO4·7H2O為基礎培養基，按15 g/L的添加量加入不同的表面活性劑及螯合劑，培養基初始pH7.0，接種量為2%，于36 ℃，200 r/min培養24 h，測定酶活，結果見圖7。由圖7可知，表面活性劑對該菌產PLD有一定的抑制作用，加入金屬螯合劑EDTA的搖瓶沒有暈圈產生，說明EDTA對該菌產PLD有強烈的抑制作用，推測原因可能是PLD為金屬酶，需要有金屬離子參與才能合成。因此，培養基中不添加表面活性劑及螯合劑。

圖7 表面活性劑及螯合劑對發酵產酶的影響Fig.7 Effects of surfactant and chelating agents on enzyme production

2.1.5 培養基配方優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用4因素3水平的正交表設計正交試驗，進一步優化產酶條件，正交試驗結果與極差分析及方差分析如表2和表3。

表2 培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

結果表明，蛋白胨含量對發酵產酶影響顯著（P＜0.05），其他因素影響不顯著（P＞0.05）。培養基優化最佳組合為A1B2C2D1，即培養基中卵黃添加量為10 g/L，蛋白胨添加量15 g/L，牛肉粉添加量2 g/L，MgSO4·7H2O添加量1 g/L。優化后的培養基組成為卵黃10 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉粉2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、氯化鈉3 g/L。

2.2 培養條件對發酵產酶的影響

2.2.1 培養基初始pH對菌體生長及發酵產酶的影響

以優化后的培養基作為發酵培養基，培養基初始pH分別調至4.5、5.5、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，接種量2%，于36 ℃、200 r/min培養24 h，測定暈圈直徑及菌體濃度，結果見圖8。由圖8可知，初始發酵pH5.5～6.5有利于菌體生長，但堿性范圍有利于產酶，初始pH8.0時，產酶活力最高。

圖8 初始pH值對菌體生長及發酵產酶的影響Fig.8 Effect of pH on cell growth and enzyme production

2.2.2 培養時間對發酵產酶的影響

以優化后的培養基作為發酵培養基，初始pH8.0，接種量2%，于36 ℃、200 r/min分別培養不同的時間，測定發酵過程中不同時間條件下菌體濃度及暈圈直徑，結果見圖9。由圖9可知，發酵初期（0～4 h）不產PLD，4 h以后開始產酶并于8 h達到最大，8 h后酶活力略有下降并趨于穩定。菌體濃度0～6 h增長較快，6～10 h增長緩慢，10～12 h增長較快，12 h后菌體濃度緩慢增長，22 h菌體濃度達到最大，之后開始下降。從菌體濃度變化曲線可以看出，PLD的產生對菌體生長不利，快速產酶期菌體濃度增長緩慢。以產酶量為目標，確定最佳培養時間為8 h。

圖9 培養時間對菌體生長及發酵產酶的影響Fig.9 Effect of incubation time on cell growth and enzyme production

2.2.3 培養溫度對菌體生長及發酵產酶的影響

以優化后的培養基作為發酵培養基，培養基初始pH 8.0，接種量2%，分別置于28 ℃、32 ℃、36 ℃、42 ℃，200 r/min培養8 h，測定暈圈直徑及菌體濃度，結果見圖10。由圖10可知，發酵溫度低有利于菌體生長，溫度為28 ℃時菌體生長良好，但溫度升高有利于產酶，其中36 ℃時發酵產酶較好，42 ℃發酵產酶略有下降，所以選36 ℃作為培養溫度。

圖10 培養溫度對菌體生長及發酵產酶的影響Fig.10 Effect of incubation temperature on cell growth and enzyme production

2.2.4 接種量對發酵產酶的影響

以優化后的培養基作為發酵培養基，培養基初始pH 8.0，接種量分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，于36 ℃、200 r/min培養8 h，測定暈圈直徑及菌體濃度，結果見圖11。由圖11可知，隨著接種量的增加，酶活力剛開始是增加的，接種量為1.0%時酶活力達到最高，繼續提高接種量，產酶活力迅速下降；菌體濃度隨著接種量的增加，一開始也是增加的，接種量3.0%時菌體濃度最高，隨后略有下降。以產酶量為目標，確定接種量為1.0%。

圖11 接種量對發酵產酶的影響Fig.11 Effect of inoculum on enzyme production

3 結論

該研究對蠟樣芽孢桿菌產PLD發酵條件進行了優化，通過單因素和正交試驗確定培養基最佳組成為卵黃10 g/L、蛋白胨15 g/L、牛肉粉2 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、氯化鈉3 g/L。最適培養條件為培養基初始pH8.0，接種量1.0%，于36 ℃、200 r/min培養8 h。在最適發酵條件下進行3批試驗，采用酶聯比色法測PLD活力，平均酶活達到4.21 U/mL，具有發酵周期短，產酶速度快的特點，為磷脂酶D工業化生產和應用奠定基礎。