富硒平菇多糖對益生菌生長代謝的研究

郭 蕓，李海濤，趙玉明，馬 玲

（1.山西藥科職業學院 食品工程系，山西 太原 030031；2.山西省生物研究所，山西 太原 030006；3.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

富硒平菇多糖是從富硒平菇中提取出的一種含硒平菇多糖，是一種高分子多糖類的活性物質，因其具有硒，所以生物功能活性較普通平菇多糖大大提高。有關硒多糖較高的抗氧化、提高免疫、抗腫瘤功能活性的報道很多[1-4]。一般的微生物不能直接利用多糖作為碳源，而益生菌可以利用其進行生長代謝并產生對人體有益的短鏈脂肪酸，從而發揮益生元的功效。有關多糖促進益生菌生長代謝的報道較多，劉麗莎等[5]對白術多糖對益生菌的促生長作用進行了研究，發現對嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolesentis）、動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的促生長效果最佳。趙玉萍[6]對真菌多糖促進鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）生長進行了研究，發現質量濃度為15 g/L的真菌多糖可以顯著促進鼠李糖乳桿菌的增殖，其活菌數最大可達到3.08×1010個/mL，能夠使發酵周期提前2～3 h。TADAYONI M 等[7]研究發現，橡子粗多糖與菊粉相比可以顯著促進植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）A7的生長。WANG X等[8]研究報道，油菜籽多糖可以促進益生菌的生長（雙歧桿菌（Bifidobacterium）、青春乳桿菌（Lactobacillus infantis）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等），AKBARI-ALAVIJEH S等[9]研究發現，開心果水溶性多糖促進了植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）PTCC 1896和鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的增殖，同時增加了乙酸、丙酸、丁酸的生成量。

本研究通過水提醇沉提取富硒平菇粗多糖，在植物乳桿菌和副干酪乳桿菌兩種益生菌培養中加入不同量的硒多糖，以菊粉為陽性對照，通過測定益生菌活菌數以及代謝過程中的產物，研究富硒平菇多糖對益生菌生長代謝的影響，為富硒平菇多糖在益生菌中的應用提供一些基礎理論，進一步為開發新型益生元、豐富益生菌代謝理論提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

平菇（硒含量37.81 mg/g干樣）、富硒平菇（硒含量622.47 mg/g干樣）：山西紫團生態農業有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）：山西農業大學食品科學與工程學院畜產品加工實驗室。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨（生化試劑）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；牛肉浸膏、酵母膏（均為生化試劑）：天津市大茂化學試劑廠；無水葡萄糖（分析純）、瓊脂粉（生化試劑）：天津市凱通化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、無水乙酸鈉（均為分析純）：天津市申泰化學試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳（均為分析純）：天津市恒興化學試劑制造有限公司；菊粉（食品級）：上海藍季科技發展有限公司。

1.1.3 培養基

酸化MRS瓊脂培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10g，酵母提取物5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.6。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

HPP-9272恒溫培養箱：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；ST16R臺式冷凍離心機：美國Thermo公司；FE28-Standard pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；CP114精密電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市城東新瑞儀器廠；1260 infinity型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富硒平菇多糖的制備

將富硒平菇粉碎后按料水比1∶20（g∶mL）加入蒸餾水，在80 ℃條件下水浴攪拌提取3 h，抽濾后收集濾液，重復提取3次，將濾液合并后真空濃縮，加入4倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，4 000 r/min、10 min離心將沉淀取出，用適量水溶解后加入Sevag 溶液（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V）除蛋白，反復3次，用適量水溶解后對水透析48 h，冷凍干燥即得含硒粗多糖[10-11]，測得粗多糖硒含量為3.21 μg/g。普通平菇粗多糖按照同樣的方法提取，測得硒含量為0.38 μg/g。

1.3.2 富硒平菇多糖對益生菌生長的影響

將植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別在MRS液體培養基中于37 ℃進行活化，然后將活化好的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別以1%接種量（約106CFU/mL）接種于添加2%平菇多糖和0.5%、2.0%的富硒平菇多糖的無葡萄糖MRS培養基中，以添加2%菊粉作為陽性對照，以添加2%葡萄糖的MRS作為普通對照，37 ℃培養24 h、48 h 后測定活菌數、pH以及有機酸生成量。

1.3.3 分析檢測

活菌數測定[12-13]：MRS 培養基，稀釋平板計數法；pH值的測定[14]：采用pH 計直接測定。

有機酸的測定[9，15]采用HPLC法，取發酵48 h的不同處理的發酵液，4 ℃條件下4 000 r/min離心20 min，上清液過0.22 μm的水膜，收集濾液進行測定，其色譜條件如下：色譜柱Accucore C18反向柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；柱溫30 ℃；流動相0.015 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈溶液，用磷酸將pH調至2.7；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；紫外檢測波長210 nm。通過和標準品進行比對定性，以峰面積計算各有機酸的相對含量。

2 結果與分析

2.1 不同處理對益生菌菌落數的影響

不同處理對副干酪乳桿菌（A）及植物乳桿菌（B）菌落數的影響結果見圖1。由圖1A可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖對副干酪乳桿菌發酵不同時間后菌落數有很大的影響，以2%葡萄糖作為對照組，發酵24 h后普通平菇多糖、不同濃度的富硒平菇多糖都使得副干酪乳桿菌的菌落數增加但差異不顯著（P＞0.05），而菊粉組（活菌數對數值8.9）增加顯著（P＜0.05），0.5%富硒平菇多糖組（活菌數對數值8.6）較2%富硒平菇多糖組（活菌數對數值8.4）促進效果更好，但都低于2%菊粉的促進效果。說明適當濃度的硒多糖促進了副干酪乳桿菌的增殖，而較高濃度硒多糖會一定程度抑制其增殖。培養48 h后的副干酪乳桿菌其菌落數都相應較24 h降低，進一步證明隨著培養時間延長，培養基的營養減少限制了副干酪乳桿菌的增殖，有一部分菌還會受到代謝產物的損失而死亡。但各多糖組菌落數仍然顯著高于葡萄糖對照組（P＜0.05），2%硒多糖組（活菌數對數值8.3）顯著高于普通多糖組（活菌數對數值8.1）（P＜0.05），同時也高于菊粉組（活菌數對數值8.2）（P＞0.05），充分說明添加硒多糖后有利于長時發酵條件下保持益生菌的活性，可能與硒對菌體在不良環境下的脅迫具有較好的保護作用有關，可能與硒被益生菌吸收后提高了自身的抗氧化酶的活性有關，也可能與發酵過程中的代謝產物如短鏈脂肪酸等作用有關[14，16]。

圖1 不同處理對副干酪乳桿菌（A）及植物乳桿菌（B）菌落數的影響Fig.1 Effect of different treatments on the viable count of Lactobacillus paracasei(A)and Lactobacillus plant(B)

由圖1B可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖對植物乳桿菌菌落數的影響不同，不同的培養時間也對植物乳桿菌菌落數的影響不同，以2%葡萄糖作為對照，發酵24 h后各處理組植物乳桿菌的菌落數顯著增加（P＜0.05），其中0.5%的富硒平菇多糖組（活菌數對數值8.4）高于其他處理組，但低于2%菌粉組（活菌數對數值8.6），發酵48 h后各處理組的菌數都相應下降，平菇多糖及富硒平菇多糖組菌數顯著高于對照組（P＜0.05），其中2%的富硒平菇多糖組（活菌數對數值8.3）顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.2 不同處理對pH的影響

不同處理對副干酪乳桿菌及植物乳桿菌pH的影響結果見圖2。由圖2A可知，添加平菇多糖和富硒平菇多糖對副干酪乳桿菌發酵后pH的影響不同，不同的培養時間也對副干酪乳桿菌pH的影響不同。發酵24 h后，以2%葡萄糖作為對照組（pH 4.1），2%普通平菇多糖（pH 4.6）和0.5%、2%富硒平菇多糖組（pH 4.4，pH 4.7）pH下降不明顯，而2%菊粉組經副干酪乳桿菌發酵后pH（pH 3.9）較低。隨著發酵時間的延長，不同處理下副干酪乳桿菌發酵液的pH進一步降低，但各處理組pH（pH分別為4.2、4.3、4.1）都高于對照組（pH 3.9）。

圖2 不同處理對副干酪乳桿菌（A）及植物乳桿菌（B）發酵液pH值的影響Fig.2 Effect of different treatments on the pH of fermentation borth by Lactobacillus paracasei (A) and Lactobacillus plant (B)

由圖2B可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖對植物乳桿菌發酵后pH的影響不同，不同的培養時間也對植物乳桿菌發酵后pH的影響不同，發酵24 h后，與2%葡萄糖（pH 4.1）作為對照，2%普通平菇多糖（pH 4.6）和不同濃度的富硒平菇多糖（pH 4.4、4.7）對植物乳桿菌發酵后pH值下降不明顯，都較菊粉組pH值高。經過48 h發酵后各組pH值都進一步降低，說明培養基中的多糖都可以被植物乳桿菌進一步利用，仍然以菊粉組的pH值（pH 3.5）最低，各多糖組pH值都高于對照組，而其中2%平菇多糖和0.5%富硒平菇多糖pH值接近（pH 4.3）。

2.3 不同處理對有機酸的影響

多糖一般不能被胃腸液中的酶分解，一般的細菌也很難利用其進行生長，而益生菌可以利用其代謝生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，其中的丙酸作為糖異生的前體底物對糖尿病人和肥胖癥有很好的功效[15]，乙酸在糖異生和脂代謝中扮演信號分子的作用，丁酸通過營養結腸細胞近而起到預防結腸癌的作用[17]，因而分析益生菌在生長過程中生成的短鏈脂肪酸是評價其益生作用的一個重要方面[18-19]，益生菌利用多糖發酵的速率取決于自身的酶系統和多糖的結構以及多糖的聚合度[9，20]。副干酪乳桿菌和植物乳桿菌兩種益生菌在添加不同濃度多糖后發酵48 h生成有機酸結果見表1。

由表1可知，添加平菇多糖及富硒平菇多糖都提高了副干酪乳桿菌和植物乳桿菌代謝生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸四種有機酸含量，其中添加0.5%富硒平菇多糖顯著提高了副干酪乳桿菌發酵后生成甲酸和丙酸的含量（P＜0.05），而2%富硒平菇多糖顯著提高了副干酪乳桿菌發酵生成甲酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量（P＜0.05），且最終濃度與2%菊粉差異不顯著（P＞0.05），充分說明平菇硒多糖可以促進副干酪乳桿菌發酵后代謝形成短鏈有機酸，從而實現益生功能。與2%葡萄糖相比，添加0.5%富硒平菇多糖的植物乳桿菌發酵48 h后丁酸、乙酸、丙酸的含量顯著增加（P＜0.05），而添加2%富硒平菇多糖的植物乳桿菌發酵48 h后丁酸、甲酸、乙酸、丙酸的含量分別顯著增加到0.41 mg/mL、0.49 mg/mL、3.61 mg/mL、4.25 mg/mL（P＜0.05），但與2%菊粉組差異不顯著（P＜0.05）。

表1 不同處理組發酵48 h后有機酸的含量Table 1 Contents of organic acids after fermentation for 48 h with different treatments mg/L

3 結論

2%富硒平菇多糖對發酵48 h副干酪乳桿菌的增殖效果優于菊粉，對植物乳桿菌的增殖效果與菊粉相當。平菇多糖和富硒平菇多糖促進了副干酪乳桿菌和植物乳桿菌代謝生成短鏈有機酸的含量，其中2%富硒平菇多糖的促進作用更強，兩種益生菌發酵后的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸含量分別比對照組（2%葡萄糖）提高了的340%、32.5%、43.4%、51.4%和122.7%、186.5%、183.3%、412.5%。發酵48 h后2%富硒平菇多糖能夠保持較高的益生菌數量。平菇多糖和富硒平菇多糖經過兩種益生菌發酵后pH下降不明顯，但兩種多糖有效促進了兩種益生菌代謝生成甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸的水平，富硒平菇多糖促進作用更好，益生作用更強。