嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1 Hsp33基因的克隆及結構分析

高麗梅，高金秀，梁蔓蔓，劉 妍，姚淑敏*

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）屬嗜熱性需氧芽孢桿菌，但兼有厭氧的特性，為革蘭氏陽性（G+）菌，芽胞孔雀綠著色。國標GB 18281.3—2015《醫療保健產品滅菌生物指示劑第3部分：濕熱滅菌用生物指示劑》中將G.stearothermophilus作為濕熱滅菌用生物指示劑。嗜熱脂肪土芽孢桿菌之所以可以在嚴苛的條件下生長，與細胞膜的結構和流動性以及蛋白質的穩定性有關[1-2]。此外嗜熱性也可能與菌體內存在著某種染色體外遺傳因子有關，但還有待進一步地研究和證實。目前，對嗜熱脂肪土芽孢桿菌的研究主要集中在某些特定的酶的研究[3-5]。但針對這些嗜高溫特性是否與該菌產生熱穩定性酶和胞膜的特殊性質有一定相關性，這種酶是什么樣的酶，這種膜具有什么樣的特殊構造等問題均需要作深入的研究。

熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）33是氧化還原分子伴侶家族的主要成員，熱休克反應導致各種熱休克蛋白的迅速產生，從而保護細胞免受不利環境對細胞生長的影響[6-8]。Hsp33最初是從研究大腸桿菌（Escherichia coli）熱休克蛋白時發現，后又在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和釀酒酵母中發現，并在保護細胞免受脅迫過程中起著重要的作用[9]。Hsp33被廣泛認為是細胞蛋白質構象和蛋白質轉換的重要介質[10]。在細菌中，特定的感官分子能夠感知溫度波動并將這種波動轉變成細胞間的信號進行傳遞。這種熱傳感器，包括核酸（脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA））和蛋白質。細菌一旦感知到應激信號，就會調用特定的分子機制來控制編碼熱休克蛋白的基因的轉錄[11]。CHUANG S E等[12-13]研究了大腸桿菌在熱和氧脅迫條件下的熱休克反應，結果表明，Hsp33在大腸桿菌處于熱和氧化環境條件時，其表達量顯著增加，而缺乏Hsp33基因的細菌，在遇到這些應激條件時，表現非常敏感。進一步研究發現，在大腸桿菌中Hsp33蛋白構象的變化影響其抗脅迫功能，Hsp33蛋白通過鋅離子的釋放，導致C端和連接區展開，并形成活性二聚體，從而阻止有害蛋白質聚集體的形成[14-15]，有效的抵御外界脅迫。近來的研究主要集中在大腸桿菌的Hsp33的結構和作用機制[16-17]的研究，對嗜熱脂肪土芽孢桿菌中Hsp33基因的研究尚鮮見報道。

本課題旨在對嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1的Hsp33基因進行克隆，利用相關軟件對其表達的蛋白結構進行分析。同時，考察熱脅迫處理對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1生長的影響，并利用反轉錄-聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）研究菌株在熱脅迫中Hsp33基因的表達情況，從而初步了解Hsp33基因在菌株的嗜熱過程中的作用。為進一步了解該菌株的嗜熱性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1：分離自死海的海水中，保存于本實驗室；DH5α感受態：北京索萊寶科技公司。

1.1.2 培養基

改良的LB培養基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 50 g/L，瓊脂18 g/L，pH值7.0。0.1 MPa、121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。液體培養基中不加瓊脂。

1.1.3 試劑

質粒pET28a、細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、One Step RT-PCR Kit：索萊寶生物技術有限公司；限制性核酸內切酶EcoR I（10 U/μL），BamH I（10 U/μL）：日本TaKaRa公司；信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）提取試劑盒：上海澤葉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Nanodrop OneC微量DNA檢測儀：美國thermofisher有限公司；T100 PCR儀：美國Bio-Rad公司；THZ-C-1恒溫振蕩培養箱：上海之信儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；HH-4水浴鍋：上海力辰儀器科技有限公司；DYCP-32A型瓊脂糖水平電泳儀：北京六一生物科技有限公司；GelDo XR+凝膠成像系統：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化

取100 μL保藏的嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1涂布于改良LB培養基，40 ℃條件下培養24 h。挑取單菌落劃線于改良LB培養基，40 ℃條件下培養24 h。挑取單菌落接種于含有50 mL改良LB液體培養基的錐形瓶中，40 ℃、180 r/min條件下培養12 h。

1.3.2 菌株DNA的提取及PCR擴增

將培養12 h的發酵液在10 000 r/min條件下離心，收集菌體，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取DNA，用微量DNA檢測儀在波長260 nm處檢測提取結果。根據已知菌株的Hsp33基因，設計相應引物，上游引物為5'-CGCGGATCCATGAGTGACTACTTAGTC-3'（下劃線部分為EcoR I酶切位點），下游引物為5'-CCGGAATTCTTATATAGCTTCTTCTTTCAT-3'（下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點）。以嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1的DNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水補充至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環35次；72 ℃再延伸5 min。PCR擴增產物經回收柱純化后用EcoRI、BamHI進行雙酶切，純化，與質粒pET-28a連接，通過電轉化導入感受態細胞大腸桿菌DH5α中。挑取陽性克隆，提取質粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 Hsp33蛋白的結構分析

使用美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）對Hsp33蛋白進行保守序列分析。采用在線軟件ExPASy（http：//www.expasy.org/tools/）中的Prot Param和Prot Scale程序對Hsp33蛋白的氨基酸組成、數目、相對分子質量及親疏水性等進行分析。使用在線軟件DNA MAN對Hsp33蛋白的氨基酸序列進行比對分析。運用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）對Hsp33蛋白的卷曲螺旋位置進行分析。采用Signal P4.1對Hsp33蛋白的信號肽進行分析。采用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）對Hsp33蛋白的α-螺旋、延伸鏈、β-轉角結構以及無規則卷曲等進行分析預測。使用在線軟件Pymol（https：//pymol.org/）對Hsp33蛋白的三級結構進行分析。

1.3.4 菌株的熱激處理

將嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1接種于改良LB液體培養基，30 ℃、180 r/min條件下培養，當OD600nm值達到0.5～0.6時，離心，收集菌體，進行熱處理。菌株分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴30 min，考察溫度對菌株存活率的影響；菌株分別在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃水浴0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，考察時間對菌株存活率的影響。將處理完的菌株，適當稀釋，然后涂布于改良LB培養基平板，進行菌落計數[18]，以未處理的菌株為對照，計算菌株存活率，其計算公式如下：

1.3.5 Hsp33基因表達的檢測

取OD600nm值為0.5～0.6的發酵液5 mL，10 000 r/min離心10 min，收集菌體，無菌水水洗兩次，用1 mL蒸餾水懸浮，然后取500 μL分別在40 ℃和50 ℃條件下熱處理20 min和30 min。采用mRNA提取試劑盒提取RNA，用微量RNA測量儀在波長260 nm處測定RNA含量。采用One-Step RT-PCR kit進行RT-PCR，具體方法參考文獻[19]。

2 結果與分析

2.1 Hsp33基因的克隆

以嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1的DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。

圖1 Hsp33基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of Hsp33 gene

由圖1可知，克隆出一條堿基長度在700～100 bp的目的條帶，將條帶回收后寄上海生工生物技術有限公司進行測序，測序結果見圖2。

圖2 Hsp33基因的核苷酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of Hsp33 gene

由圖2可知，Hsp33基因的堿基長度為876 bp，為一個完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對，發現該基因與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1vzy的Hsp33基因相似性達到99%，與阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）Hsp33的基因相似性達到99%。說明克隆的基因是Hsp33基因序列。將該基因序列提交至NCBI，通過BLAST比對，對Hsp33蛋白的保守序列進行分析，結果見圖3。

圖3 Hsp33蛋白保守序列分析Fig.3 Conserved sequence analysis of Hsp33 protein

由圖3可知，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33屬于HslO超基因家族，在羧基端具有4個半胱氨酸殘基構成的依賴氧化還原激活開關，此外具有7個氨基酸殘基構成的二聚體表面結合位點和7個氨基酸殘基構成的二聚體結構域結合位點。

2.2 Hsp33蛋白結構分析

通過Prot Param程序對嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白進行一級結構分析，結果顯示，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白由292個氨基酸組成，相對分子質量為31 706.20，蛋白質理論等電點為4.93，編碼的蛋白質分子式為C1395H2238N374O438S14，蛋白質不穩定系數為33.02，蛋白質親水性平均值為-0.157。其酸性氨基酸和親水性氨基酸較多（經比較，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白與Bacillussubtilis1vzy的Hsp33蛋白親水性基本相似，但親水性都低于Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655的Hsp33蛋白）。蛋白序列含有20種氨基酸，含量最多的是丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸。含量較少的為組氨酸、色氨酸，其中堿性氨基酸32個、酸性氨基酸40個（經比較，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白與Bacillus subtilis1vzy的Hsp33蛋白電負性均低于Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655的Hsp33蛋白）。使用在線軟件DNA MAN對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1、Bacillus subtilis1vzy的Hsp33氨基酸序列進行比對，結果見圖4。

圖4 嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1與枯草桿菌1vzy的Hsp33氨基酸序列比對結果Fig.4 Alignment results of amino acid sequences of Hsp33 from Geobacillus stearothermophilus GL-1 and Bacillus subtilis 1vzy

由圖4可知，兩菌株的Hsp33氨基酸序列的一致性為73.3%，序列相似性為86.9%，同源性較高，親緣關系較近。

對嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白的疏水性、卷曲螺旋位置及蛋白的信號肽進行分析，結果見圖5。

圖5 嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1的Hsp33蛋白的疏水性（A）、卷曲螺旋（B）、信號肽（C）分析結果Fig.5 Analysis results of hydrophobicity (A),crimp helix (B) and signal peptide (C) of Hsp33 protein from Geobacillus stearothermophilus GL-1

由圖5可知，Hsp33蛋白的疏水性氨基酸數量為126，無卷曲螺旋、信號肽。利用SOPMA軟件分析嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白的二級結構，并且與Bacillus subtilis1vzy和Escherichia colistr.K-12 substr.MG1655 Hsp33蛋白進行比較，結果發現，嗜熱脂肪土芽孢桿菌的Hsp33蛋白的α-螺旋結構在二級結構中占比較大，為44.52%，而β-折疊和β-轉角僅占很少一部分。有文獻報道，較多的α-螺旋氨基酸殘基的存在有利于蛋白質結構的穩定，提高蛋白質的熱穩定性[20]。使用在線軟件Pymol構建嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1、枯草桿菌1vzy的Hsp33蛋白的三級結構，結果見圖6。

圖6 嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1（A）與枯草芽孢桿菌1vzy（B）的Hsp33蛋白的三級結構Fig.6 Tertiary structure of Hsp33 protein of Geobacillus stearothermophilus GL-1 (A) and Bacillus subtilis 1vzy (B)

由圖6可知，嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1、枯草芽孢桿菌1vzy的Hsp33蛋白除C末端結構域有所差距外，其他部分基本相同，說明兩者具有相似的核心結構域，這也更加證明了兩者之間的同源性。對于兩者結構的差異對蛋白質性質的影響有待于研究。

2.3 熱脅迫對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1生長的影響

圖7 熱脅迫對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1存活率的影響Fig.7 Effect of heat stress on the survival rate of Geobacillus stearothermophilus GL-1

由圖7可知，嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1在不同溫度處理下存活率變化很大，在40 ℃、50 ℃處理30 min后，菌株存活率分別為95%、93%；在60 ℃處理30 min后，菌株存活率降至65%；處理溫度＞60 ℃之后，隨著溫度的升高存活率逐步下降，在90 ℃處理30 min后，菌株存活率0.5%。

由圖8可知，40 ℃條件下處理嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1存活率保持恒定，基本維持在90%以上；50 ℃條件下處理時間＞40 min之后，菌株的存活率陡然下降，70 min時接近1%；60 ℃條件下處理30 min，菌株的存活率下降到35%，70 min時存活率＜1%；70 ℃條件下處理10 min，菌株的存活率降至65%，30 min時存活率＜1%。結果表明，菌株可以耐受40 ℃高溫。

圖8 熱脅迫時間對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1存活率的影響Fig.8 Effect of heat stress time on the survival rate of Geobacillus stearothermophilus GL-1

2.4 熱脅迫條件下Hsp33基因的表達

圖9 RT-PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.9 Results of agarose gel electrophoresis of RT-PCR amplification products

由圖9可知，與對照組相比，嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1經熱處理后Hsp33基因表達量增加。在40 ℃條件下熱處理20 min，菌株Hsp33的基因表達量比處理30 min低。50 ℃條件下熱處理20 min和30 min，菌株Hsp33基因的表達量基本相同，但均高于40 ℃熱處理時菌株Hsp33基因的表達量。

3 結論

通過PCR擴增獲得嗜熱脂肪土芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）GL-1的Hsp33基因，該基因堿基長度為876 bp，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）1vzy的Hsp33基因序列相似性達到99%，其表達的蛋白質結構與Bacillus subtilis1vzy的Hsp33蛋白具有相似的核心結構域，二者除C-末端稍有不同外，具有相同的β-折疊和α-螺旋，無卷曲螺旋。熱脅迫對嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1生長具有影響，當嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1菌株受到熱脅迫時，Hsp33基因表達量增加，說明在受到脅迫時，Hsp33蛋白作出了應激反應，可以抵御環境脅迫給細胞帶來的傷害。在嗜熱脂肪土芽孢桿菌GL-1中，Hsp33基因表達與外界脅迫的關系還需要進一步的研究和探討。