大腸桿菌ptsG基因缺陷菌株的構建及其發酵混合糖產L-丙氨酸

潘海亮，王 燦，趙 筱，王永澤，王金華*

（湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

L-丙氨酸是人體一種非必需氨基酸，在日化、食品和醫藥等領域有著廣泛的應用，可以用作甜味劑、營養液和蛋白質合成原料[1]。據研究，L-丙氨酸在工業塑料領域上有著巨大的商業價值[2]。目前L-丙氨酸主要以葡萄糖為原料進行發酵而獲得，這就意味著每年需要大量的小麥或玉米等糧食作物用于生產丙氨酸，這是與人爭糧的不利局面。

木質纖維素在地球廣泛存在且可再生，其水解液中含有大量的五碳糖和六碳糖，其中主要為木糖和葡萄糖[3]。以廉價的木質纖維素糖源為原料進行發酵生產是近來的研究熱點，其關鍵是解除發酵中葡萄糖對其他碳源產生的分解碳代謝物阻遏效應（carbon catabolite repression，CCR）[4]，即葡萄糖效應（glucose effect，GE）。解除葡萄糖效應使大腸桿菌能同時利用葡萄糖和木糖進行生物制造的相關研究已有報道。采用菌株選育或混菌發酵方式可有效緩解葡萄糖效應，如CORDARO J C等[5]利用磷霉素從大腸桿菌野生菌中篩選出了不通過糖類磷酸轉移酶系統（phosphatase transporter system，PTS）轉運糖類的菌株[6]，乙醇產量提高了20%；EITEMAN M A等[7]通過在培養基中加入兩種分別只利用葡萄糖和木糖的大腸桿菌來生產乳酸，完全避免了葡萄糖效應。而采用工程菌構建方式，直接將PTS途徑相關基因進行突變被認為是目前解除葡萄糖效應的主要途徑之一[8]。通過敲除PTS轉運系統中葡萄糖轉運酶基因（glucose transporters gene，ptsG）來增強大腸桿菌對混合糖的利用，已廣泛利用于聚羥基脂肪酸酯[9]、琥珀酸[10]、乙醇[11]和D-乳酸[12]等產物的發酵之中，并取得了不錯的效果。如本實驗室構建的ptsG基因缺陷菌株E.coliSZ470P能同時利用葡萄糖和木糖發酵產乙醇，產量提高了14.32%[11]，構建的ptsG缺陷菌株E.coliJH-15也能同時利用木糖和葡萄糖[12]，且D-乳酸產量提高了25.86%。

本研究在前期獲得了一株高產丙氨酸（糖酸轉化率＞95%）的工程菌株基礎上，基于利用混合糖發酵丙氨酸的目的，擬通過Red同源重組（Red homologous recombinatioin）技術[13]構建ptsG基因缺陷菌株，以減弱混合糖發酵丙氨酸時的葡萄糖效應從而提高發酵效率，為利用木質纖維素這種可再生的原料生產丙氨酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

出發菌為大腸桿菌（Escherichiacoli）基因工程菌JH-B2[2]（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔpflB：：alaD），可以高效利用葡萄糖和木糖產丙氨酸，由本實驗室前期構建并保存；E.coliJH-B3是通過Red同源重組技術獲得的ptsG基因缺陷菌株。質粒pKD4含有包含了硫酸卡那霉素（kanamycin，Kan）抗性基因的FRT-kan-FRT閱讀框和氨芐青霉素（ampicillin，Amp）抗性基因，pKD46包含編碼Red重組系統的基因和Amp抗性基因[14]，兩種質粒均由武漢天一輝遠生物技術有限公司購得。實驗所需引物均由武漢天一輝遠生物技術有限公司合成，引物名稱和序列見表1。

表1 擴增及驗證引物Table 1 Primers used for amplification and verification

根據質粒pKD4和ptsG的兩側基因序列設計了擴增引物P1、P2，靠近5'端未加下劃線的序列分別與ptsG基因兩端序列同源，靠近3'端加下劃線的序列分別與質粒pKD4上Kan基因兩側序列互補。又根據擴增引物P1、P2設計了驗證引物P3、P4，驗證引物序列與擴增引物上ptsG兩側各20 bp序列相同。

1.1.2 化學試劑

CaCl2·2H2O（分析純）、L-阿拉伯糖（生化試劑）、醋酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：香港基因有限公司；DL 20000 DNA Maker、PCR Master Mix：美國Fermentas公司；溴化乙錠（分析純）：廣州賽國生物科技有限責任公司；10×TE溶液、卡那霉素、氨芐青霉素：浙江Mersco工貿有限公司。

1.1.3 培養基

Luria-Bertabi（LB）培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L氯化鈉，5 g/L酵母粉，20 g/L瓊脂粉。

卡那抗性篩選培養基：LB固體培養基中加入氨芐青霉素50 mg/L。

種子培養基：LB液體培養基中加入20g/L葡萄糖或木糖。

發酵培養基為LB液體培養基：100 g/L葡萄糖，100 g/L木糖和100 g/L混合糖（50 g/L葡萄糖和50 g/L木糖）。

上述培養基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；MTV-12V6HE-R凝膠自動成像儀：美國Major Science公司；My Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、MicroPulser電轉儀：美國Bio-Rad公司；Waters e2695高效液相色譜儀：美國Waters公司；Sartorius BB-8846880發酵罐：德國Sartorius Stedim Biotech公司；SBA-40D生物傳感儀：山東省科學院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌工程菌E.coliJH-B3菌株構建

以pKD4質粒為模板，用擴增引物P1、P2進行聚合酶鏈式反應（PCR），以獲得帶有卡那抗性基因的PCR擴增片段，然后用3 mol/L的醋酸鈉和體積分數95%的乙醇沉淀和純化卡那抗性基因PCR擴增片段。PCR擴增體系：無菌水22μL、模板1 μL、引物P1和P2各1 μL、PCR Master Mix 25 μL。PCR反應條件：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環30次。

用CaCl2法[15]將pKD46 轉化到E.coliJH-B2 細胞中，經過氨芐青霉素抗性平板篩選后以獲得陽性轉化子E.coliJH-B2/pKD46，在氨芐平板上純化2～3代；挑取E.coliJH-B2/pKD46的單菌落至含2%L-阿拉伯糖的LB 液體培養基培養，30 ℃、200 r/min條件下培養至菌液的光密度值（OD600nm值）達到0.5～0.6，將菌液轉移至已提前預冷的50 mL離心管中并置于冰上30 min；冰浴后于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，去除上清液，用已滅菌的超純水反復洗滌細胞沉淀4次，最后用轉移至1.5 mL預冷的EP管中于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，去掉上清液，并用100 μL超純水重懸；將E.coliJH-B2/pKD46的重懸菌液和10 μL卡那抗性基因PCR擴增片段混合均勻后置于冰上20 min，再轉入已預冷的電擊杯中，連接電轉儀，在2 000 V條件下電擊4～5 ms；向電擊杯中加入1 mL已預冷的無氯化鈉的LB培養基，轉移至1.5 mL EP管中，于30 ℃、150 r/min條件下復蘇培養3 h；將復蘇培養液涂布于含卡那霉素的LB 平板上，于37 ℃恒溫條件下培養24 h，篩選陽性轉化子命名為E.coliJH-B3。

1.3.2 重組菌株JH-B3的驗證

分別以E.coliJH-B2和JH-B3的菌落為模板，用驗證引物P3、P4進行PCR 擴增獲得片段，然后將兩者的PCR擴增片段與卡那抗性基因PCR擴增片段以及20 000 bp DNA Marker進行電泳和凝膠成像，通過比三者條帶的大小來驗證ptsG基因是否敲除成功。若成功，則在含卡那霉素LB固體培養基（含50 mg/L卡那霉素）的無氧管中將E.coliJH-B3連續培養10代，篩選陽性轉化子用于后續發酵實驗。

1.3.3 發酵實驗

將菌株E.coliJH-B2和JH-B3分別在7 L發酵罐中進行厭氧發酵，碳源依次為10%葡萄糖、10%木糖及10%混合糖（5%葡萄糖＋5%木糖），轉速恒定在200 r/min，發酵溫度恒定在37 ℃，發酵pH恒定在6.80，以26%的氨水為發酵中和劑。每隔固定時長取樣，并檢測葡萄糖、木糖和丙氨酸含量，對比兩種菌株利用葡萄糖和木糖的能力，以及產丙氨酸的能力。每次發酵實驗進行3次平行實驗，同一發酵時間點的數據視為一組平行數據并取平均值。

1.3.4 分析檢測

葡萄糖：采用生物傳感儀檢測法[16]；木糖：采用高效液相色譜分析法。其色譜條件為Bio-Rad HPX 87H色譜柱（300mm×7.8mm），流動相為4mmol/LH2SO4，流速0.4mL/min，柱溫45 ℃，檢測器為示差檢測器[17]；

丙氨酸：采用高效液相色譜法。其色譜條件為依利特C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相為0.05 mol/L的Na2HPO4溶液，用磷酸調節pH至6.5，CH3OH和Na2HPO4溶液體積比為1∶9；流速0.80 mL/min；紫外檢測器，檢測波長210 nm，溫度30 ℃，進樣量5 μL[18]。

2 結果與分析

2.1 ptsG基因缺陷菌株JH-B3驗證

ptsG基因自身長度約1 434 bp，則以對照菌株E.coliJH-B2為模板通過驗證引物P3、P4（約20bp）得到的PCR擴增片段理論大小約為1 434 bp；FRT-kan-FRT閱讀框約1 477 bp，則以pKD4質粒為模板通過擴增引物P1、P2（約65 bp）得到的卡那抗性基因PCR擴增片段理論大約為1 567 bp；當利用同源重組將菌株JH-B2上ptsG基因置換為卡那抗性基因PCR擴增片段而獲得菌株JH-B3后，再以JH-B3為模板通過引物P3、P4得到的PCR擴增片段理論大小約為1 567 bp，與卡那抗性基因PCR擴增片段相同，并與JH-B2的PCR擴增片段長度相差約133 bp。分別對DNA Maker、JH-B2的PCR擴增片段、JH-B3的PCR擴增片段以及卡那抗性基因的PCR擴增片段進行凝膠電泳和成像，其結果見圖1。

圖1 ptsG基因缺陷菌株JH-B3的PCR鑒定Fig.1 Identification of ptsG gene-deficient strain JH-B3 by PCR

由圖1可知，經凝膠電泳成像后，JH-B2 的PCR擴增片段大小約1 430 bp，JH-B3的PCR擴增片段和卡那抗性基因的PCR擴增片段大小約1 560 bp，兩者基本相同且與JH-B2的PCR擴增片段相差約130 bp，實驗結果與理論結果基本一致，由此可知ptsG基因缺陷菌株E.coliJH-B3構建成功。

2.2 兩種菌株利用葡萄糖的能力對比

對照菌株JH-B2和ptsG基因缺陷菌JH-B3 在分別以10%葡萄糖為碳源下發酵產丙氨酸情況見圖2。

圖2 兩種菌株利用葡萄糖發酵產丙氨酸能力比較Fig.2 Comparison of alanine production fermented by two strains with glucose

由圖2可知，在菌體生長方面，菌株JH-B2的生物量（OD600nm值）在發酵20 h后進入穩定期，OD600nm值最大為7.29，而ptsG基因缺陷菌株JH-B3在28 h后進入穩定期且OD600nm值最大為8.26；在20 h之前菌株JH-B2的生物量高于菌株JH-B3，而20 h之后菌株JH-B3的生物量都高于菌株JH-B2。在利用葡萄糖方面，菌株JH-B2在36 h發酵結束，平均耗糖速率為2.78 g/（L·h），而菌株JH-B3在48 h發酵結束，平均耗糖速率為2.08 g/（L·h），兩者后期耗糖速率都變慢，這可能是后期丙氨酸產生反饋抑制導致的[19]。菌株JH-B3較JH-B2利用葡萄糖的平均速率降低了25.18%，發酵周期延長了33.33%。在生產丙氨酸方面，菌株JH-B2最終生產丙氨酸98.7 g/L，生產強度2.74 g/（L·h）；JH-B3最終產生產丙氨酸98.2 g/L，生產強度為2.05 g/（L·h），JH-B3較JH-B2的生產強度降低了25.18%。

結果表明，ptsG基因的敲除可以明顯的降低大腸桿菌攝取利用葡萄糖的能力，并且ptsG缺陷菌株JH-B3的生物量高于對照菌，這可能是因為ptsG的敲除減少了乙酸的積累從而有利于菌體生長，以及JH-B3攝取的葡萄糖較多地用于菌體生長[20]，導致JH-B3具有更高的生物量，也導致了JH-B3的丙氨酸產量略低于JH-B2。

2.3 兩種菌株利用木糖能力對比

對照菌株JH-B2和ptsG基因缺陷菌JH-B3 在分別以10%葡萄糖為碳源下發酵產丙氨酸情況見圖3。由圖3可知，在菌體生長方面，在發酵48 h后菌株JH-B3和JH-B2的生物量都進入穩定期，OD600nm值最大分別為6.3和6.42，兩者的生長趨勢幾乎相同。在利用木糖方面，菌株JH-B2在216 h發酵結束，平均耗糖速率為0.46 g/（L·h）；菌株JH-B3在218 h發酵結束，平均耗糖速率為0.46 g/（L·h），兩者利用木糖情況基本相同。在生產丙氨酸方面，菌株JH-B2發酵最終生產丙氨酸89.9 g/L，生產強度為0.42 g/（L·h）。JH-B3發酵最終產生產丙氨酸89.6 g/L，生產強度為0.41 g/（L·h），兩者產丙氨酸情況也基本相同。

圖3 兩種菌株利用木糖發酵產丙氨酸能力比較Fig.3 Comparison of alanine production fermented by two strains with xylose

結果表明，在以木糖為唯一碳源時，敲除ptsG基因對菌株發酵產丙氨酸無明顯的影響，這是因為大腸桿菌內木糖有獨立于葡萄糖的轉運和分解代謝途徑，ptsG基因編碼的轉運蛋白只轉運葡萄糖而不轉運木糖。

2.4 兩種菌株利用混合糖能力對比

在以10%混合糖（5%葡萄糖＋5%木糖）發酵時，對照菌株JH-B2和ptsG基因缺陷菌株JH-B3的菌體生長情況、耗糖情況及丙氨酸產量見圖4。由圖4A可知，在24 h之前，菌株JH-B2的生物量（OD600nm值）均比菌株JH-B3大，而24 h之后菌株JH-B3的生物量（OD600nm值）反超JH-B2且始終比JH-B2大；菌株JH-B2的生物量在28 h之后進入穩定期，最大的OD600nm值為6.58，而JH-B3的生物量在40 h后進入穩定期，最大的OD600nm值為7.32。結果表明，ptsG基因缺陷菌株JH-B3所攝取的糖更多的用于菌體生長，因而具有更高的生物量。其生長趨勢與在10%葡萄糖培養基中相一致。

圖4 菌株JH-B2和JH-B3在混合糖中的生長曲線（A）、耗糖（B）及丙氨酸產量（C）Fig.4 Growth curves (A),sugar consumption (B) and alanine production(C)of strain JH-B2 and JH-B3 in mixed sugar

由圖4B可知，菌株JH-B3同時開始利用葡萄糖和木糖，發酵32 h時利用完葡萄糖，發酵至98 h利用完木糖，而菌株JH-B2利用完葡萄糖后才開始利用木糖，發酵24 h利用完葡萄糖，發酵28 h時開始利用木糖且至98 h還剩余18.1 g/L木糖未利用。菌株JH-B2和JH-B3消耗葡萄糖的速率分別為2.08 g/（L·h）和1.56 g/（L·h），消耗木糖的速率分別為0.33 g/（L·h）和0.51 g/（L·h）。結果表明，敲除ptsG基因在降低大腸桿菌攝取利用葡萄糖的能力同時，變向增強了其對木糖的攝取利用能力，使大腸桿菌在混合糖發酵中能同時利用葡萄糖和木糖，大幅地減弱了葡萄糖效應帶來的不利影響。由圖4C可知，在發酵24 h之前，菌株JH-B2的丙氨酸產量都高于菌株JH-B3，這是因為在24 h之前，雖然菌株JH-B3同時在利用葡萄糖和木糖產丙氨酸，但利用木糖的速率還很慢，而菌株JH-B2雖然不能利用木糖，但利用葡萄糖產丙氨酸的速率卻大于菌株JH-B3利用葡萄糖和木糖產丙氨酸的速率之和；在發酵24 h之后，菌株JH-B3的丙氨酸產量卻逐漸超過菌株JH-B2，這是因為兩種菌株在利用完等量葡萄糖的過程中，菌株JH-B3利用木糖產丙氨酸的能力卻遠大于菌株JH-B2；在發酵32 h之后，兩種菌株產丙氨酸的速率基本相同，這是因為32 h時菌株JH-B3的葡萄糖也被利用完，兩者利用木糖的速率基本相同。發酵至98 h，菌株JH-B2丙氨酸產量為77.6 g/L，轉化率為94.7%，生產強度為0.79 g/（L·h），而菌株JH-B3丙氨酸產量為94.1 g/L，轉化率為94.1%，生產強度為0.96 g/（L·h），菌株JH-B3的生產強度較菌株JH-B2提高了21.5%，這是因為此時菌株JH-B3已經利用完所有糖，而菌株JH-B2尚剩余18.1 g/L的木糖未轉化成丙氨酸。

3 結論

大腸桿菌在混合糖（葡萄糖＋木糖）發酵過程中，會優先攝取利用葡萄糖，待葡萄糖利用完后停滯一段時間才開始利用木糖，這種現象被稱為CCR效應，也被稱為葡萄糖效應。因此決定混合糖發酵周期和效率的關鍵因素是菌株對木糖的利用速率。大量研究表明，葡萄糖效應與PTS轉運系統有關。PTS系統負責特異性地將葡萄糖轉運至細胞內，并將其磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。PTS系統中的ptsG基因編碼EIICBGlc在葡萄糖的轉運和磷酸化中起到重要的作用。理論上敲除ptsG基因可以降低大腸桿菌轉運葡萄糖的速率和降低磷酸化水平，從而抑制葡萄糖效應[21]。

本實驗以大腸桿菌基因工程菌JH-B2為出發菌株，通過Red同源重組技術，敲除了磷酸轉移酶系統中的關鍵基因ptsG，得到了ptsG基因缺陷菌株JH-B3。在以10%混合糖（5%葡萄糖＋5%木糖）發酵產丙氨酸時，JH-B3能同時利用葡萄糖和木糖，大幅度減小了葡萄糖效應所帶來的不利影響，其木糖利用速率和丙氨酸生產強度較對照菌JH-B2的分別提高了54.5%和21.5%，并且其轉化率高達94.1%。本次實驗為利用廉價的木質纖維素產丙氨酸提供了理論基礎。