心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

田冬梅 袁李禮

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科（合肥230022）；2湖南省腦科醫(yī)院心內(nèi)科（長(zhǎng)沙410007）

阿霉素是一種臨床應(yīng)用廣泛的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥［1］，效果顯著，但其所使用過(guò)程中會(huì)造成心臟毒性效應(yīng)等不良反應(yīng)，限制其臨床應(yīng)用，嚴(yán)重影響患者的治療效果和生存質(zhì)量［2］。研究表明阿霉素化療2年內(nèi)心臟損傷的發(fā)生率超過(guò)一半［3］，心臟毒性效應(yīng)的防治是臨床和基礎(chǔ)關(guān)注的研究熱點(diǎn)。心脈隆注射液是美洲大蠊中分離出的一種國(guó)家二類(lèi)新藥，主要用于治療慢性心力衰竭［4］，研究［5-7］報(bào)道其能具有心臟保護(hù)功能。阿霉素造成心臟毒性效應(yīng)可能與心肌凋亡有關(guān)［8］，自噬與凋亡之間存有交互調(diào)控。而心脈隆注射液對(duì)于阿霉素心臟損傷動(dòng)物模型的作用機(jī)制是否與凋亡-自噬相關(guān)仍不完全明確。本研究擬觀察心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟損傷的保護(hù)作用的影響，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制，為其用于防治臨床阿霉素心臟損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠30 只，體質(zhì)量（32 ± 2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度保持在（23 ± 2）℃，濕度維持在40% ～60%，明暗交替時(shí)間12 h/12 h。

1.2 材料和試劑心脈隆注射液購(gòu)自云南騰藥制藥股份有限公司、阿霉素購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、乳酸脫氫酶（LDH）和磷酸肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測(cè)采用日立7600 型全自動(dòng)生化分析儀、HE 染液和DAB 顯色試劑購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司、一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司、兔抗LC3 單克隆抗體、相應(yīng)二抗購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 動(dòng)物模型與分組SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠30 只隨機(jī)分為3 組。對(duì)照組10 只：腹腔注射等體積生理鹽水7 d；阿霉素組10 只：腹腔注射阿霉素10 mg/kg 2 d+腹腔注射等體積生理鹽水5 d；心脈隆+阿霉素組10 只：腹腔注射阿霉素10 mg/kg 2 d+腹腔注射心脈隆注射液250 mg/kg 5 d。

1.4 樣本收集小鼠處理7 d 后，腹腔注射水合氯醛麻醉后心臟穿刺采血，3 000 r/min 離心收集血清，用于心肌酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。心肌組織收集后用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，用于HE 染色、組織凋亡和自噬分析。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 HE 染色將切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片后顯微鏡觀察。

1.5.2 心肌酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)取200 μL 血清，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH 和CK-MB 水平。

1.5.3 心肌組織凋亡檢測(cè)TUNEL 將切片脫蠟至水、修復(fù)破膜后，利用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇10 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）= 凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)× 100%。

1.5.4 心肌組織自噬檢測(cè)將切片脫蠟至水、抗原修復(fù)后血清封閉、LC3 一抗4 ℃孵育過(guò)夜、二抗孵育、DAB 顯色復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片后顯微鏡觀察，隨機(jī)選擇10 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行組間比較，最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟組織病理的影響HE 染色結(jié)果顯示，阿霉素能導(dǎo)致小鼠心臟組織纖維細(xì)胞和肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂、局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心脈隆處理改善阿霉素小鼠心肌組織上述形態(tài)學(xué)變化，見(jiàn)圖1。

圖1 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟組織病理的影響Fig.1 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac histopathology in mice

2.2 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)的影響心肌酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，阿霉素引起小鼠LDH 和CK-MB 升高（P＜0.05），心脈隆處理組小鼠LDH 和CK-MB 較阿霉素模型組降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced myocardial enzymes in mice

2.3 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟組織細(xì)胞凋亡的影響TUNEL 實(shí)驗(yàn)顯示，正常組小鼠心臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)低于5%，阿霉素能夠引起小鼠心臟組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（綠色熒光增多）（P＜0.05），心脈隆處理能夠降低阿霉素所增加的小鼠心臟組織細(xì)胞凋亡（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟組織自噬的影響LC3 免疫組化結(jié)果顯示，正常組小鼠心臟組織自噬水平低，阿霉素能夠誘導(dǎo)小鼠心臟組織自噬（棕色增多）（P＜0.05），心脈隆處理能夠降低阿霉素所增加的小鼠心臟組織自噬（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖3 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac apoptosis in mice

圖4 心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟組織自噬的影響Fig.4 Effect of Xinmailong injection on doxorubicin-induced cardiac autophagy in mice

3 討論

阿霉素作為一種非選擇性廣譜高效化療藥物，用于多種癌癥的治療，但其臨床應(yīng)用被其嚴(yán)重的副作用限制，其中最突出的是心臟損傷。本研究制備阿霉素小鼠心臟損傷模型，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，阿霉素組心肌組織損傷、心肌酶學(xué)指標(biāo)LDH 和CK-MB 升高（P＜0.05），提示模型制備成功；心脈隆注射液處理減輕阿霉素小鼠心肌組織損傷、降低心肌酶學(xué)指標(biāo)（P＜0.05），明確了心脈隆注射液對(duì)阿霉素小鼠心臟損傷的保護(hù)作用，心脈隆可能作為臨床防治阿霉素心臟損傷的潛在藥物。

目前關(guān)于阿霉素導(dǎo)致的心臟損傷的機(jī)制很多，細(xì)胞凋亡對(duì)于生物體的發(fā)育及體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡中起作用［9］。阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡在心臟損傷中發(fā)揮重要作用［10］。阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制涉及多個(gè)方面［11］：（1）阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞膜Fas 和FasL 表達(dá)，增加Fas/FasL 結(jié)合，激活Caspase-8 啟動(dòng)凋亡；（2）阿霉素導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，膜電位降低，細(xì)胞色素C 釋放至胞漿，激活Caspase-9 啟動(dòng)凋亡；（3）阿霉素心肌細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶途徑，促進(jìn)促凋亡基因Bax 表達(dá)，抑制抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL 表達(dá)，從而導(dǎo)致凋亡；（4）阿霉素增加P53 蛋白表達(dá)和心肌細(xì)胞凋亡，且不受Caspase 抑制劑的影響。抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡能夠有效防止其導(dǎo)致的心臟損傷，本研究結(jié)果證實(shí)阿霉素能引起小鼠心臟組織細(xì)胞凋亡，心脈隆注射液處理后抑制心臟組織細(xì)胞凋亡，提示心脈隆注射液對(duì)阿霉素心臟損傷的保護(hù)作用可能與其減輕細(xì)胞凋亡相關(guān)。

自噬與凋亡之間存有交互調(diào)控，二者能被多種刺激激活、互相轉(zhuǎn)化［12］。阿霉素能影響自噬，但自噬在心肌細(xì)胞的存活和死亡中具有雙重作用。研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理所引起的自噬能對(duì)抗阿霉素的心臟毒性，利用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素能減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性［13］，適度饑餓導(dǎo)致的自噬同樣也能減輕阿霉素的急性心臟損傷［14］。而阿霉素所誘導(dǎo)的自噬則更多的與其心臟毒性相關(guān)，且呈現(xiàn)出復(fù)雜性。自噬的過(guò)程包括幾個(gè)步驟，包括自噬雙層膜結(jié)構(gòu)和自噬體的形成，自噬體和溶酶體的融合和降解。透射電子顯微鏡觀察顯示阿霉素增加心肌組織細(xì)胞中自噬體的形成和累積［15］。阿霉素能夠通過(guò)抑制溶酶體從而抑制自噬流，自噬體無(wú)法通過(guò)溶酶體降解而聚集，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)聚積，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡和心臟損傷［16］。自噬抑制劑3-MA、Beclin-1 或ATG5 等自噬相關(guān)基因沉默均可對(duì)抗阿霉素的心臟損傷［17］。本研究結(jié)果顯示阿霉素能誘導(dǎo)小鼠心臟組織自噬，心脈隆注射液處理后能減輕心臟組織自噬，提示心脈隆注射液對(duì)阿霉素心臟損傷的保護(hù)作用可能其抑制自噬，從而減輕細(xì)胞凋亡相關(guān)。

本研究首次提出心脈隆注射液通過(guò)影響心肌細(xì)胞自噬/凋亡發(fā)揮發(fā)揮對(duì)阿霉素小鼠心臟損傷的保護(hù)作用，加強(qiáng)了其心臟保護(hù)作用的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)，也將為臨床防治阿霉素心臟損傷方面提供了新的潛在藥物。但是本研究還具有一定的局限性，研究?jī)H明確了心脈隆影響心肌細(xì)胞自噬/凋亡，但其具體的調(diào)控靶點(diǎn)還需進(jìn)一步深入探討，此外，心脈隆注射液應(yīng)用于臨床阿霉素心臟缺乏相關(guān)的臨床大數(shù)據(jù)支持，仍需要開(kāi)展更多的多中心臨床試驗(yàn)觀察。綜上所述，心脈隆注射液能夠減輕心肌組織細(xì)胞凋亡和自噬水平，發(fā)揮對(duì)阿霉素小鼠心臟損傷的保護(hù)作用。本研究為臨床預(yù)防和治療阿霉素心臟損傷提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。