干擾ZEB1表達對結直腸癌細胞上皮間質轉化與增殖、凋亡與遷移的影響

鐘軒 王紅鈺 蔣濤 馬鵬程 張超 鄭寶軍 劉金鳳

開灤總醫院 1普外科，3急診科（河北唐山063000）；2唐山市工人醫院腫瘤外科（河北唐山063000）

結直腸癌（CRC）是最常見的高發消化道腫瘤之一，多發于男性［1］，并且發病率呈逐漸上升趨勢，目前主要采用手術結合放化療的綜合治療方式，雖然取得了一定的治療效果并改善了患者生存質量，但卻未從根本上改善結直腸癌患者的預后，特別是中晚期發生肝轉移及肺轉移患者的5年生存率仍未得到明顯提高［2-3］。影響患者生存率的主要原因為腫瘤細胞過度增殖與轉移，因此抑制腫瘤的生長、轉移，促進其凋亡可降低病死率［4-5］。因此，探討結直腸癌無限增殖及轉移相關的分子與分子機制具有重要的理論價值與臨床意義，可進一步闡明結直腸癌的惡性特征并制定更為有效的靶向治療方案。

近年來的研究表明，結直腸癌細胞上皮間質轉化的發生是腫瘤細胞擴散轉移的重要分子機制［6-7］，其中，轉錄抑制因子ZEB1 在該過程中發揮了重要的調節作用［8］。ZEB1 又稱鋅指E 盒結合蛋白1，為鋅指E 盒結合蛋白（ZEB）家族成員之一，其可能在胚胎發育及創傷愈合等過程中起作用［9］。隨著近年來研究的深入，檢測到ZEB1 在人體內多種腫瘤中發揮著重要作用，如在乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等腫瘤中ZEB1 的表達增高［10-13］。雖然目前關于ZEB1 的研究有所進展，但是ZEB1 調控腫瘤細胞擴散轉移的具體分子機制尚未完全明確，有關ZEB1 在結直腸癌發生發展、浸潤轉移過程中作用的研究尚且不多。前期臨床研究發現ZEB1 在人結直腸癌組織中呈高表達，且在結直腸癌Ⅲ+Ⅳ期（88.9%、91.7%）的表達明顯高于結直腸癌Ⅰ+Ⅱ期［14］，提示ZEB1 與結直腸癌的遠處擴散、轉移密切相關。故本實驗進一步觀察干擾ZEB1表達對體外結直腸癌細胞上皮間質轉化與增殖、凋亡與遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞人結直腸癌細胞HT29、LOVO、SW480 購買于上海信裕生物工程有限公司；人正常結直腸上皮細胞FHC 購買于上海冠導生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑慢病毒pPLK-ZEB1-shRNA、pPLK-control-shRNA 由上海生工生物工程技術有限公司設計并合成；RPMI-1640 培養基（CS-0013-0026，上海莼試生物技術有限公司）；胎牛血清（10270106，廣州威佳科技有限公司）；McCoy′s 5A培養基（PM150710，武漢普諾賽生命科技有限公司）；L-15 培養基（L1518，Sigma）；RT-PCR 試劑（上海冠導生物工程有限公司）；E-cadherin、Vimentin、Twist、GAPDH 抗體（美國CST 公司）；PCR 反應試劑盒（PR2101，北京百泰克生物技術有限公司）。

1.1.3 主要儀器熒光顯微鏡（DFM-60C，上海蔡康光學儀器有限公司）；酶標儀（HBS-1096A，南京德鐵實驗設備有限公司）；倒置顯微鏡（BLD-220，北京世紀科信科學儀器有限公司）；96 孔板、6 孔板（無錫國盛生物）；流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國BD）。

1.2 方法1.2.1 細胞培養將人結直腸癌細胞SW480 在含體積分數10%胎牛血清的L-15 培養基內培養；人結直腸癌細胞HT29 在含體積分數10%胎牛血清的McCoy′s 5A 培養基內培養；人結直腸癌細胞LOVO 在含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基內培養；人正常結直腸上皮細胞FHC 在含體積分數10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養基內培養。4 種細胞的培養環境：37 ℃、5%CO2與95%濕度的恒溫培養箱中。每2 ～3 天換液1 次，觀察細胞生長融合至85%左右時進行傳代培養，取處于對數生長期的細胞用于實驗。RT-PCR 檢測4 種細胞中ZEB1 基因表達，篩選ZEB1 基因表達最高的細胞進行轉染實驗。

1.2.2 干擾ZEB1 表達取對數生長期的LOVO細胞，以2 × 105/孔的細胞密度接種于6 孔板內，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養箱內，第2 天進行瞬時轉染：干擾組轉染慢病毒pPLK-ZEB1-shRNA，干擾對照組轉染慢病毒pPLK-control-shRNA，每組3 復孔，shRNA 的終濃度為100 nmol/L，嚴格依照慢病毒感染說明書操作。轉染48 h后，熒光顯微鏡及RT-PCR、Western Blot 檢測檢測觀察轉染效率。以未轉染的細胞為正常對照（Control 組）。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖轉染48 h 后，將3 組細胞以4 × 103/孔的細胞密度接種于96 孔板內，每組3 復孔，置于37 ℃、5%CO2與95%濕度的恒溫培養箱中，于培養的對應時間點取出培養板，加入5 g/L MTT 溶液20 μL，孵育4 h 后終止培養，加入150 μL DMSO，利用酶標儀在490 nm 處檢測OD值。

1.2.4 克隆形成實驗轉染48 h 后，制備3 組單細胞懸液，以4 × 102/孔的細胞密度接種于6 孔板內，每組3 復孔，置于37 ℃、5%CO2與95%濕度的恒溫培養箱中培養，第15 天時終止培養，PBS 清洗細胞3 次，甲醛固定15 min，結晶紫染色15 min，雙蒸水洗滌后自然干燥，顯微鏡下計數＞50 個細胞克隆數，計算克隆形成率。

1.2.5 Transwell實驗轉染48 h 后，制備3 組單細胞懸液，調整細胞濃度為1.5 × 105/mL，將200 μL細胞懸液接種于小室上層，將600 μL 含體積分數10%胎牛血清的完全培養基加入小室下層，37 ℃孵育4 h，取出小室上層，除去殘留在小室表面的細胞，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定，以結晶紫染色15 min，PBS 清洗后自然干燥，倒置顯微鏡下隨機選擇5 個視野，計數遷移穿膜細胞數。

1.2.6 細胞凋亡檢測轉染48 h 后，取3 組細胞，調整細胞濃度為4 × 105/mL 接種，消化后加入70%乙醇溶液固定1 h，PBS 清洗細胞，加入PI 進行染色重懸，利用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.7 RT-PCR 檢測提取各組細胞總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA 的完整性。按照試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，反應程序為：95 ℃，5 min；95 ℃，20 s；60 ℃，1 min；共45 個循環。ZEB1 上游引物：5′- TGC ACT GAG TGT GGA AAA GC-3′，下游引物：5′- TGG TGA TGC TGA AAG AGA CG-3′。GAPDH 上游引物：5′-CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA-3，下游引物：5′- TTC ACA CCC ATG ACG AAC AT-3′。每個樣品重復3 次實驗。利用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。

1.2.8 Western Blot 檢測轉染48 h 后，蛋白裂解液裂解各組細胞，提取總蛋白，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測濃度，低溫保存備用。將蛋白液與Loading Buffer 充分混勻，100 ℃煮10 min，分別制作分離膠與濃縮膠，按照每孔50 μg 蛋白上樣，加入分離膠孔內，電泳轉膜并封閉，加入一抗：ZEB1稀釋1∶1 000，1E-cadherin 稀釋1∶10 000，Vimentin稀釋1∶7 000，Twist 稀釋1∶1 000，4 ℃搖床孵育過夜；PBST 洗膜，二抗常溫孵育1 h，PBST 洗膜后ECL 顯色進行灰度值分析。

1.3 統計學方法采用統計學軟件SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料以均數± 標準差表示，兩組間對比采用t檢驗，多組間對比采用方差分析，進一步兩兩比較采用Snk-q檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測ZEB1 基因表達ZEB1 基因在人正常結直腸上皮細胞FHC 中呈低表達，在3 種結直腸癌細胞中呈高表達，并且高侵襲性人結直腸癌細胞LOVO 中的ZEB1 基因表達高于低侵襲性的人結直腸癌結果細胞HT29、SW480，見圖1。ZEB1 蛋白Western Blot 檢測結果與RT-PCR 檢測一致，見圖2。

2.2 轉染效率將ZEB1 基因沉默慢病毒pPLKZEB1-shRNA 載體感染人結直腸癌細胞LOVO，熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，可見瞬時轉染陽性率為（90.12 ± 4.15）%，慢病毒pPLK-control-shRNA 瞬時轉染率也在90%以上（圖3A），初步證實轉染成功。RT-PCR 檢測顯示，干擾組ZEB1 基因表達明顯低于干擾對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。

2.3 MTT 檢測細胞增殖于培養的第1、3、5、7 天檢測細胞增殖，結果顯示干擾組培養第3 ～7 天的細胞增殖OD值低于干擾對照組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干擾對照組與正常對照組的細胞增殖OD值比較差異無統計學意義（圖4）。

圖1 RT-PCR 檢測不同細胞中的ZEB1 基因表達Fig.1 Detection of ZEB1 gene expression in different cells by RT-PCR（n = 3）

圖2 Western Blot 檢測不同細胞中的ZEB1 基因表達Fig.2 Western Blot detection of ZEB1 gene expression in different cells（n = 3）

2.4 克隆形成實驗干擾組細胞克隆形成數目少于干擾對照組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干擾對照組與正常對照組細胞克隆形成數目比較差異無統計學意義（圖5）。

2.5 Transwell 實驗干擾組、干擾對照組、正常對照組遷移穿膜細胞數目分別為（31.23 ±9.13）%、（60.32 ± 12.34）%、（62.27 ± 10.55）%，干擾組遷移穿膜細胞比例少于干擾對照組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干擾對照組與正常對照組遷移穿膜細胞比例比較差異無統計學意義（圖6）。

圖3 熒光顯微鏡與RT-PCR 檢測轉染效率（n = 3）Fig.3 Detection of transfection efficiency by fluorescence microscopy and RT-PCR

圖4 MTT 檢測細胞增殖（n = 3）Fig.4 MTT assay for cell proliferation

圖5 克隆形成實驗（n = 3）Fig.5 Clone formation experiment

2.6 細胞凋亡檢測干擾組、干擾對照組、正常對照組的凋亡率分別為（18.19 ± 6.23）%、（4.27 ±1.34）%、（4.36 ± 1.88）%，干擾組細胞凋亡率多于干擾對照組、正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；干擾對照組與正常對照組細胞凋亡率比較差異無統計學意義（圖7）。

2.7 Western Blot 檢測干擾組E-cadherin 蛋白表達高于干擾對照組、正常對照組，Vimentin、Twist蛋白表達低于干擾對照組、正常對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；干擾對照組與正常對照組E-cadherin、Vimentin、Twist 蛋白表達比較差異無統計學意義（圖8）。

3 討論

結直腸癌是發病率與病死率較高的常見惡性消化道腫瘤，目前的研究證據還無法明確其發病機制，因此從分子水平深入探討結直腸癌的發病機制、尋找新的可靠的靶基因具有非常重要的臨床意義。

近年來的研究發現ZEB1 在多種腫瘤中存在基因擴增與過度表達。呂金燕等［15］臨床研究證實ZEB1 在乳腺癌組織中呈高表達，且與病理組織學分類、淋巴轉移、組織學分級及HER-2、Ki-67 顯著相關（P＜0.05）。陳登宇等［16］的基礎研究發現，靶向降低BGC823 胃癌細胞ZEB1 的水平，可降低lncRNA HOTAIR 水平及細胞增殖、侵襲、遷移力。汪楠等［17］ZEB1 免疫組化表達與惡性腫瘤相關性的Meta 分析顯示，組織表達ZEB1 可以促進腫瘤的發生，ZEB1 的表達與腫瘤形成有一定程度的關系，對腫瘤早期診斷有一定的參考價值。

圖6 Transwell 遷移實驗Fig.6 Transwell migration experiment（×100，n = 3）

圖7 細胞凋亡檢測Fig.7 Apoptosis detection（n = 3）

圖8 Western Blot 檢測E-cadherin、Vimentin、Twist 蛋白表達Fig.8 Western Blot detection of E-cadherin，Vimentin and Twist protein expression（n = 3）

為了探究ZEB1 與結直腸癌發生及發展的關系，前期研究利用免疫組織化學SP 方法檢測在結直腸癌組織、良性病變組織（腸鏡下取檢提示不典型增生或息肉）、癌旁正常黏膜組織中ZEB1 的表達，顯示ZEB1 的陽性表達率在癌組織組（73.63%）明顯高于結直腸良性病變組（17.8%）及癌旁正常組織組（13.3%），ZEB1 的陽性表達率在結直腸癌的Ⅲ+Ⅳ期組（88.9%）明顯高于結直腸癌Ⅰ+Ⅱ期組（58.3%），差異均具有統計學意義（P＜0.05），研究結果表明ZEB1 可能在結直腸癌的發生與發展中發揮著重要作用［14］。但有關ZEB1 在結直腸癌中的具體生物學功能還有待研究。

為進一步探討ZEB1 與結直腸癌細胞生長與遷移的關系，本實驗應用沉默病毒載體感染ZEB1表達最高的結直腸癌細胞株，觀察干擾ZEB1 表達對細胞增殖、凋亡與遷移能力的影響。實驗發現，干擾ZEB1 表達可抑制人結直腸癌細胞珠LOVO 的增殖、克隆形成率與遷移能力，促進其凋亡，提示ZEB1 在人結直腸癌細胞的生長與轉移中扮演著重要角色，為促癌基因，但其作用機制還需要進一步的研究。

研究［18-21］已證實ZEB1 可能通過調節上皮間質轉化參與腫瘤的發生與發展。上皮間質轉化的主要特征即是上皮細胞極性與細胞間連接的喪失，并獲得了間質細胞的表型，提高了遷移性與侵襲性。很多轉錄因子有具有誘導上皮間質轉化的作用，包括Snail 家族、bHLH 家族、ZEB 家族。上皮間質轉化的過程主要表現為上皮細胞標志物E-cadherin 及細胞角蛋白等的表達降低，而間質細胞標志物，如Vimentin、N-cadherin、纖維粘連蛋白等的表達增加。作為上皮間質轉化期間轉錄抑制因子之一的ZEB1，可結合到E-cadherin 的CDH1（編碼E-Cadherin）啟動子上，最終導致E-cadherin 表達下調，增加上皮細胞的間質特性，進而促進腫瘤細胞擴散、轉移。前期研究發現，E-Cadherin 在結直腸癌組中的表達明顯低于其在結直腸良性病組及正常黏膜組中的表達，且ZEB1 與E-Cadherin在結直腸癌組織中的表達呈負相關（r= -0.625，P＜0.01），表明E-Cadherin 表達在結直腸癌腫瘤細胞組織的遠處擴散轉移方面有著十分重要的作用。本實驗結果顯示，干擾ZEB1 表達可提高上皮間質轉化E-cadherin 蛋白表達，降低Vimentin、Twist 蛋白表達（P＜0.05），提示干擾ZEB1 表達可抑制結直腸癌腫瘤細胞的上皮間質轉化過程，從而抑制腫瘤細胞的增殖與遷移能力。

研究初步證實，干擾ZEB1 表達可抑制人結直腸癌細胞的增殖、遷移能力，增加細胞凋亡，抑制其上皮間質轉化。但是ZEB1 可通過結合多種癌蛋白或腫瘤抑制因子來調節上皮間質轉化過程，其也受到microRNA 的調控，所以作用機制還需要進一步明確。接下來將通過動物體內實驗進一步驗證體外實驗結果。