胎膜早破孕婦B族鏈球菌感染以及相關蛋白的表達情況分析

周嫻 胡燕玲

1江漢大學醫學院（武漢430056）；2武漢市中心醫院（武漢430014）

胎膜早破即臨產前孕婦胎膜出現破裂情況，具有發病率高及病情危害大的特征，極易引起胎兒窒息、早產、胎兒窘迫、臍帶脫垂以及難產等，影響母嬰結局［1］。胎膜早破致病因素尚不明確，臨床多認為生殖道感染是該疾病的誘因之一，而引起生殖道感染的一種細菌即B 族鏈球菌，但B 族鏈球菌與胎膜早破的關系仍處于研究階段，相關資料也鮮有報道［2］。近年來，有研究發現細胞過度凋亡可能會引起胎膜早破，B 細胞淋巴瘤基因-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）以及Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）均為凋亡調控基因，但兩種蛋白在胎膜早破孕婦中的作用仍存在爭議。已有學者［3］對胎膜早破絨毛膜羊膜堿性成纖維細胞生長因子與Bax、Bcl-2 的表達進行研究，但對于胎膜早破孕婦B 族鏈球菌感染以及相關蛋白的表達情況的研究卻鮮有報道。對此，為分析胎膜早破孕婦的B 族鏈球菌感染情況及相關蛋白的表達情況，進一步驗證B 族鏈球菌與胎膜早破的關系及Bcl-2 和Bax 對胎膜早破孕婦中的作用，此次以武漢市中心醫院2016年12月至2019年2月收治的60 例胎膜早破孕婦及60 例無胎膜早破孕婦為對象展開研究，旨在為胎膜早破的預防及干預提供理論依據，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象以武漢市中心醫院2016年12月至2019年2月收治的60 例足月胎膜早破孕婦為觀察組，年齡22 ～33 歲，平均（27.61 ± 1.33）歲；孕周37 ～41 周，平均（38.97 ± 0.32）周；產次1 ～3 次，平均（1.58 ± 0.26）次；體質量60 ～83 kg，平均（71.59± 3.73）kg。同期選取60 例足月無胎膜早破孕婦為對照組，年齡21 ～34歲，平均（27.59±1.42）歲；孕周38 ～41 周，平均（39.26 ± 0.29）周；產次1 ～3 次，平均（1.60±0.23）次；體質量61 ～82 kg，平均（71.61±3.69）kg。兩組孕婦年齡、孕周、產次以及體質量等一般資料對比差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準（編號：1906604）。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準（1）滿足《婦產科學》［4］中與“胎膜早破”相關標準相符者；（2）溝通能力良好；（3）精神狀態正常；（4）破膜12 h 內接受終止妊娠；（5）患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準（1）合并心臟病；（2）合并妊高癥；（3）合并血液系統疾病；（4）合并妊娠期糖尿病；（5）入院前7 d 內曾出現病毒感染或者細菌感染，且接受抗生素治療。

1.2.3 實驗材料（1）主要儀器：光學顯微鏡選購于奧林巴斯有限公司，切片機購于德國徠卡，載玻片購于世泰有限公司，電烤箱購于格蘭仕，高壓蒸汽滅菌鍋購于上海博迅實業有限公司；（2）主要試劑：二甲苯溶液選購于南京新凱化工有限公司，乙醇選購于國藥集團，蘇木素購精購于貝索有限公司，1%鹽酸乙醇溶液購于上海榕柏生物技術有限公司，0.5%氨水溶液購于巨能世紀信息科技（蘇州）有限公司，中性樹膠購于萊科醫療儀器有限公司，磷酸鹽緩沖液、二抗、抗原修復液以及抗體稀釋液均購于北京中杉金橋生物技術有限公司，3%過氧化氫溶液購于赫澎（上海）生物科技有限公司，封閉用正常山羊血清工作液購于北京百奧萊博，Bcl-2 以及Bax 試劑均購于Arigo，通用型二氨基聯苯胺顯色溶液購于赫澎（上海）生物科技，1%鹽酸酒精購于上海榕柏生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采集樣本（1）孕35 ～37 周時，對孕婦肛周、陰道下側1/3 處的分泌物進行提取，進行專業培養，待孕婦入院后對B 族鏈球菌的測定結果進行追溯；（2）胎盤分娩后，對胎膜組織樣本進行提取，定位孕婦胎膜口約4 cm 點，對胎膜組織進行剪取，面積3 cm × 3 cm，以生理鹽水對樣本組織表面的羊水以及血跡進行反復沖洗后，以福爾馬林妥善固定。給予胎膜組織常規包埋，對蠟塊標本切片處理，厚度控制在4 μm 左右，并選取其中較為滿意的2 張切片；（3）對2 張切片分別進行Bcl-2及Bax 免疫組化染色，觀察其表達情況。

1.3.2 測定B 族鏈球菌于瓊脂上接種胎膜樣本，放置于37 ℃的黑暗有氧環境中，培養1 d 觀察典型菌落，若1 d 后無典型菌落出現，延長培養時間至2 d。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色（1）以蒸餾水沖洗胎膜組織表面固定液，取足量組織放置于標本框中，標記取材順序，予以脫水。以75%乙醇對胎膜組織進行浸泡，12 h 后分別置入85%、90%、95%乙醇及無水乙醇中浸泡1 h，取出后再用二甲苯溶液予以浸泡1 h，2 次，1 h/次。加熱石蠟后，置入模具，并將樣本組織放入模具內；（2）以切片機對蠟塊進行切片，厚度控制4 μm 左右，再將切片妥善放入展片器中，放于載玻片表面，于室溫環境下將其晾干，置入電烤箱（維持60 ℃恒溫）內過夜，并于每張蠟塊內選取4 張滿意切片；（3）將切片放置于二甲苯溶液內，予以常規脫蠟15 min 后，置入無水乙醇內浸泡，2 次，5 min/次，將二甲苯充分洗凈后，分別以95%、80%及70%的乙醇進行5 min 處理，再用自來水進行3 min 沖洗，并用蘇木素予以染色，3 min 后再次以自來水進行1 min 沖洗，放入1%鹽酸乙醇溶液中進行分化，1 min 后以自來水進行1 min 沖洗，置于0.5%氨水溶液中反藍，約20 s 后再次用自來水對其沖洗1 min，予以伊紅染色，2 min后以自來水進行1 min 沖洗，依次放入70%、80%乙醇內脫水5 min，再依次放入95%以及無水乙醇中予以5 min 浸泡，連續2 次后，以二甲苯進行透明處理，2 次，10 min/次，最后以中性樹膠對其進行封片，置于顯微鏡下分析與觀察。

1.3.4 免疫組化檢驗（1）將切片放入二甲苯中進行浸泡，2 次，10 min/次，依次以無水乙醇、95%及70%乙醇進行5 min浸泡，并以蒸餾水清洗1 min后，再以磷酸鹽緩沖液進行沖洗，2 次，5 min/次；（2）切片妥善放在載玻架上，將抗原修復液加入切片表面，放入高壓蒸汽鍋內，將其煮沸，2 min 后取出冷卻，再用磷酸鹽緩沖液進行沖洗，2 次，5 min/次；（3）于切片表面滴入3%過氧化氫溶液，于室溫環境中放置3 min 后，以磷酸鹽緩沖液進行沖洗，2 次，5 min/次；（4）于切片表面滴加封閉用正常山羊血清工作液，靜置20 min后，去除多余的液體，將切片妥善放進濕盒內，分別滴加50 μL Bcl-2以及Bax一抗，靜置1 h 后，以磷酸鹽緩沖液進行沖洗，3 次，5 min/次；（5）滴加40 μL 二抗，靜置1 h 后，再以磷酸鹽緩沖液進行沖洗，3 次，5 min/次，于切片表面滴加通用型二氨基聯苯胺顯色溶液，于鏡下控制、觀察顯色時間；（6）以自來水對切片進行10 min 沖洗，終止反應后，去除表面液體，以蘇木精進行復染，2 min后將切片放入1%鹽酸酒精中，使其分化后，用自來水進行15 min沖洗，再根據1.3.3中流程進行常規脫水處理、透明處理、封片以及鏡檢。

1.4 判讀結果（1）免疫組化檢測的陽性標準［5］：于光學顯微鏡×200下對切片進行觀察，選擇5個高倍視鏡，觀察細胞膜以及細胞漿，以其是否有棕黃色的顆粒出現為依據對表達性質進行判斷，并對染色強度分數及陽性細胞組織比例得分的總和進行計算，取平均值，即可獲取陽性表達強度。（2）陽性細胞組織的比例標準［6］：0 分：未出現陽性細胞；1分：陽性細胞組織的比例不足25%；2分：陽性細胞組織的比例在25%～50%之間；3 分：陽性細胞組織的比例超過50%。（3）染色強度的評分標準［7］：0 分：不著色；1分：淡黃色；2分：棕黃；3分：棕褐。陽性表達度為0 分時即為陰性（-），弱陽性（+）為1 ～2 分，陽性（++）為3 ～4 分，強陽性（+++）為5 ～6 分。（4）B族鏈球菌的陽性標準［8］：可見培養基中出現淺粉至紅色菌落，以珍珠狀為主。

1.5 統計學方法以SPSS 20.0 軟件進行分析，劑量資料以（）表示，予以t檢驗，例（%）表示計數資料，χ2檢驗，以多元線性回歸或Spearman秩相關展開相關性分析，并以Graphpad Prism 7默認參數對ROC曲線展開分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 B 族鏈球菌感染情況觀察組中，有22 例B族鏈球菌感染，感染率是36.67%，比對照組的10例（16.67%）高，差異有統計學意義（χ2= 6.136，P= 0.013）。120 例孕婦中，共有32 例B 族鏈球菌感染，總感染率是26.67%。

2.2 Bcl-2 陽性表達及Bax 陽性表達的特征Bcl-2 陽性表達的特征：胞漿內、絨毛膜細胞組織內以及羊膜上皮細胞膜中均有棕黃色顆粒存在，見圖1。且Bcl-2表達強度不斷增強，患者胎膜早破發生的風險性隨之降低，兩者間表現出劑量反應關系。Bax陽性表達的特征：胞漿中、絨毛細胞組織中以及羊膜上皮細胞膜中有棕黃色顆粒大量分布，見圖2。且Bax 表達的強度增加，其胎膜早破的發生風險也會隨之增加，兩者間表現出劑量反應關系。

2.3 胎膜早破與Bcl-2 表達及Bax 表達的關系觀察組患者Bcl-2 陽性表達率45.00%，比對照組的86.67%低，而觀察組患者是Bax 陽性表達率是85.00%，比對照組的51.67%高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。兩組孕婦Bcl-2 表達及Bax 表達強度見表2。根據表2可見，Bcl-2 及Bax 陽性表達均與胎膜早破存在關系，且Bcl-2 表達強度與胎膜早破發生風險呈負相關，Bcl-2 表達強度增加，胎膜早破發生風險降低，具有劑量反應關系，χ2趨勢= 13.571，P＜0.001，且根據OR值發現，Bcl-2 是胎膜早破的保護性因素；而Bax 表達強度與胎膜早破發生風險呈正相關，Bax 表達強度增加，胎膜早破發生風險也升高，具有劑量反應關系，χ2趨勢= 17.153，P＜0.001，且根據OR值發現，Bax 是胎膜早破的危險因素。

圖1 Bcl-2 表達圖像Fig.1 Bcl-2 expression image

圖2 Bax 表達圖像Fig.2 Bax expression image

2.4 Bcl-2 表達及Bax 表達間的關系采用2*C表分類資料的關聯性分析方法計算χ2= 21.273 ＞= 11.34（P＜0.05），說明觀察組患者胎盤組織中的Bcl-2 及Bax 表達間存在相關性，關聯強度r= 0.389。

表1 兩組孕婦Bcl-2 表達及Bax 表達比較Tab.1 Comparison of Bcl-2 expression and Bax expression between the two groups of pregnant women 例（%）

表2 兩組孕婦Bcl-2 表達及Bax 表達強度Tab.2 Bcl-2 expression and Bax expression intensity in two groups of pregnant women 例

2.5 B 族鏈球菌感染的分層情況下胎膜早破與Bcl-2 表達及Bax 表達的關系觀察組22 例B 族鏈球菌陽性，38 例陰性，對照組10 例B 族鏈球菌陽性，50 例陰性。存在B 族鏈球菌感染時，兩組患者Bcl-2 表達及Bax 表達組間對比差異無統計學意義（P＞0.05）；未存在B 族鏈球菌感染時，觀察組患者Bcl-2 陽性表達率55.26%，比對照組的88.00%低，而觀察組Bax 陽性表達率89.47%，比對照組的54.00%高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 B 族鏈球菌對胎膜早破與Bcl-2 表達及Bax 表達的關系的影響Tab.3 Effect of group B streptococcus on premature rupture of membranes and expression of Bcl-2 and Bax expression 例（%）

3 討論

胎膜早破在妊娠中晚期孕婦中的發生率較高，約10%左右，是引起難產、產褥感染以及胎兒窘迫等不良妊娠結局的主要因素之一，嚴重的情況下還可能引起胎兒死亡［9］。臨床研究［10-11］發現，多種因素以及基因調控的綜合影響下，胎膜細胞組織的凋亡速度會加快，不僅會破壞胎膜結構，還會使其功能受損，導致胎膜延展性降低，引起胎膜早破，因此認為胎膜細胞組織的過度凋亡與胎膜早破之間存在一定聯系。

B 族鏈球菌寄生于人體泌尿生殖系統、空腸、大腸以及回腸中，以球形為主，經革蘭染色后呈現出紫色，健康人身體中B 族鏈球菌的攜帶率超過35%，而孕婦攜帶率介于10%～30%間［12］。本次納入研究的120 例孕婦B 族鏈球菌總感染率是26.67%，與既往資料相符。B 族鏈球菌會對絨毛膜產生作用，具有較強的穿透力以及黏附力，B 族鏈球菌感染導致炎性細胞組織大量生成，并發揮吞噬作用，同時B 族鏈球菌感染還可能會促使蛋白水解酶生成，并對胎膜組織產生影響，使其延展性受損，引起胎膜早破［13］。本次研究對60 例胎膜早破孕婦及60 例無胎膜早破孕婦展開分析，發現胎膜早破孕婦中B 族鏈球菌感染率是36.67%，比無胎膜早破孕婦中的16.67%高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明胎膜早破孕婦B 族鏈球菌感染的概率較高，而B 族鏈球菌則是引起胎膜早破的一種危險因素。

大量研究資料［14-15］顯示，氧化應激、感染、細胞凋亡以及免疫等因素均可能引起胎膜早破。胎膜中含有大量膠原纖維，直接決定胎膜張力水平，一旦膠原纖維韌性、完整狀態受損，胎膜組織抗張力性隨之降低，同時彈性也會受到影響，引起胎膜早破［16］。細胞凋亡為人體細胞組織按照程序逐漸死亡的一種形式，為正常生理過程，隨著內外環境的不斷改變，基于基因調控作用下，細胞組織出現程序性死亡是人體穩步發展的前提條件，細胞凋亡能夠使其身體中多余細胞組織、受損細胞組織及時清除［17］。研究［18］發現，多種疾病的出現以及病情發展都與細胞凋亡存在密切聯系，人體處于健康狀態時，其體內細胞凋亡增值及其死亡處于平衡水平，如果該平衡狀態被破壞，細胞凋亡過程就可能出現異常調控，導致有害細胞組織大量存活，引起疾病。Bcl-2 以及Bax 均為細胞凋亡蛋白基因，而且還是Bcl-2 家族中的一對調控凋亡基因，Bcl-2 家族的構成成分包括大量促Bax 蛋白以及Bcl-2 蛋白，對于內源性通路起著調控作用［19］。MIKHAILOV［20］等研究表明，胎膜組織中細胞出現過度凋亡是引起胎膜早破的主要因素之一，Bcl-2表達異常降低，同時Bax 表達明顯升高，使胎膜組織結構呈現出變薄、弱化或者老化等異常改變，影響胎膜功能及其組織張力，一旦宮腔壓力在胎膜組織所能承受壓力之上，就可能引起胎膜早破。本次研究發現，觀察組患者Bcl-2 陽性表達率比對照組低，而Bax 陽性表達率比對照組高，差異有統計學意義，且觀察組患者Bcl-2 及Bax 表達間呈負相關（P＜0.05），表明Bcl-2 及Bax 表達均在胎膜早破中起著參與作用，且Bcl-2 表達強調降低、Bax 表達強度升高，胎膜早破發生風險也隨之增加，原因可能是Bcl-2 及Bax 表達失衡，導致胎膜細胞組織的凋亡基因受影響，發揮促凋亡作用，進而導致胎膜早破。此外，本次研究還發現，未存在B 族鏈球菌感染時，胎膜早破孕婦Bcl-2 陽性表達率比未胎膜早破孕婦的低，而Bax 陽性表達率比胎膜早破孕婦的高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明B族鏈球菌感染還會對胎膜早破與Bcl-2 表達及Bax表達的關系產生影響。

綜上所述，孕婦出現胎膜早破的危險性因素之一即B 族鏈球菌感染，不僅Bcl-2 低表達、Bax 高表達會增加胎膜早破風險，而且B 族鏈球菌感染會對Bcl-2 及Bax 表達與胎膜早破間的關系產生影響。本次實驗較以往研究，不僅證實B 族鏈球菌感染與胎膜早破的關系，也為Bcl-2 及Bax 對胎膜早破孕婦中的作用提供有力證據。