NOD1rs7789045基因多態性與廣西漢族人群原發性抗中性粒細胞胞漿抗體相關性血管炎的關系

李雪 薛超 黎偉 黃莉 曹越琦 何佩耕

廣西醫科大學第二附屬醫院腎內科（南寧530007）

原發性抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）是一組以小血管炎癥和壞死為主要特征的多系統自身免疫性疾病，主要包括顯微鏡下多血管炎，肉芽腫性多血管炎和嗜酸性粒細胞GPA 等［1］。作為一種多系統自身免疫疾病，AAV 進展迅速，在肺和腎受累中很常見。各種AAV 亞型具有截然不同的地理和種族分布，這表明AAV 發病機制中存在多種復雜因素［2］。ANCA 自身免疫反應的起源是一個多因素的過程，目前原因尚不能明確，主要認為與環境佐劑因子、自身免疫調節以及遺傳傾向等有著密切的關系。遺傳因素在AAV 發病機制中的重要作用是通過種族差異、家庭聚集和遺傳研究發現的［3］。研究表明AAV 的基因單核苷酸多態性（SNPs）對疾病具有一定的遺傳易感性［4-6］。目前已有報道顯示NOD1 基因多態性與自身免疫性疾病的發病密切相關，如克羅恩病［7］，格林-巴利綜合征［8］，特應性濕疹［9］等。NOD1參與多種疾病的發生發展，深入認識其在疾病中的作用機制，對于探索更新的研究思路和更有效的治療方法有所幫助，分析AAV 的遺傳易感性對AAV 的診斷、治療及其預后具有重要意義。目前NOD1 基因多態性在中國內地人群中的分布及與AAV 患者的關系仍缺乏研究。本研究旨在探討NOD1 rs7789045 基因多態性與AAV 發病的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2005年1月至2018年12月在廣西醫科大學第二附屬醫院中確診的79 例廣西漢族AAV（病例組）患者，直系親屬三代均為漢族人，其中男35 例，女44 例，診斷標準均參照2012年CHCC 國際血管炎命名會議的標準，并排除AAV 之外的繼發性血管炎。對照組為112 例在年齡、性別等與病例組相匹配的廣西漢族健康人群，其中 男45 例，女67 例，年齡18～82 歲。所有患者和健康體檢者均通過倫理委員會批準并獲得其知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數據收集收集79 例在廣西醫科大學第二附屬醫院中確診AAV 患者的臨床資料、實驗室資料。其中臨床資料包括姓名、性別、年齡及發熱、皮疹、關節痛、水腫、蛋白尿等伴隨癥狀，實驗室檢驗資料包括血白細胞（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血漿白蛋白（Alb）等相關指標。

1.2.2 基因組DNA 提取抽取待檢測者2 mL EDTA 抗凝外周血，采用DNA 提取試劑盒（來自北京天根生化科技有限公司），嚴格按照說明書方法提取。

1.2.3 NOD1 rs7789045A/T 基因型分析采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術。上游引物（F）：5′-AAAGAAGACTCCTGCCCCAG-3′、下游引物（R）：5′-GACCCTACACTGTGCTGGAT-3′（引物由上海生工生物工程有限公司所合成）。PCR 反應總體系20 μL，反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環，隨后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。限制性內切酶PvuII（美國Thermo Fisher scientific公司）消化以上PCR 擴增目的片段，反應體系為PCR DNA 5 μL，ddH2O 9 μL，PvuII 0.5 μL，buffer 2 μL。在37 ℃恒溫下水浴30 min，酶切產物以2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統下觀察NOD1 rs7789045 A/T 基因型

1.2.4 基因型測序分別選取NOD1 rs7789045 的AA（野生型）、AT（雜合突變型）、TT（純合突變型）3 種基因型多例送上海生工生物工程有限公司測序以驗證結果準確性。

1.3 統計學方法采用統計軟件SPSS 22.0，以Hardy-Weinberg（HW）平衡平衡吻合度檢驗群體的代表性。分析比較病例組與對照組基因型及等位基因頻率采用χ2檢驗，并計算優勢比（odds ratio，OR）、95%置信區間（95% confidence interval，95%CI）；近似正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析；非正態分布、方差不齊者以中位數M（P25，P75）表示，采用Kruskal-WallisH秩和檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NOD1 rs7789045 基因型目的基因的擴增片段大小為197 bp。經酶切后，AA 基因型為一條帶（197 bp），AT 基因型為三條帶（197、114、83 bp），TT 基因型為兩條帶（114、83 bp）。見圖1。測序結果與酶切結果相符合，說明目的基因擴增以及酶切準確。見圖2。

2.2 NOD1 rs7789045 兩組基因型及等位基因頻率病例組與對照組基因型、等位基因分布頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。兩組在NOD1 rs7789045各基因型及等位基因分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 病例組基因型間臨床癥狀比較79 例病例組3 種基因型臨床癥狀中發熱、皮疹、水腫、蛋白尿、關節痛癥狀發生率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.4 病例組基因型間實驗室檢驗指標比較79 例病例組3 種基因型中實驗室檢驗資料中WBC、Hb、BUN、Scr、Alb 水平差異比較無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 NOD1 rs7789045A/T PCR 產物及3 種基因型電泳圖Fig.1 Electropherogram of NOD1 rs7789045A/T PCR product and three genotypes

圖2 NOD1 rs7789045 A/T 3 種基因型測序圖Fig.2 NOD1 rs7789045 A/T three genotype sequencing map

表1 NOD1 rs7789045A/T 病例組與對照組基因型及等位基因頻率比較Tab.1 Comparison of genotype and allele frequency of NOD1 rs7789045A/T case group and control group例（%）

表2 病例組NOD1 rs7789045 A/T3 種基因型臨床癥狀的比較分析Tab.2 Comparative analysis of clinical symptoms of NOD1 rs7789045 A/T three genotypesin the case group 例（%）

3 討論

AAV 是一種自身免疫性疾病，其主要特征是小血管壞死性炎癥和ANCA，可影響全身多系統，嚴重者危及生命，治療后易復發［10］。近年來，隨著對AAV 認識的不斷深入，檢測方法和診斷標準的不斷完善，其可能對患者生命產生嚴重性的威脅，AAV 受到了許多學科的廣泛關注。然而，不可忽視的是，該疾病的發病機制研究中仍存在許多尚未解決的問題。在使用現有治療方案治療后，一些患者仍然難以完全緩解或容易復發。ANCA 是AAV 的重要發病機制，其與韋格納肉芽腫病之間的聯系已得到充分證實［11］。一些學者發現蛋白酶3 抗體刺激可增強人單核細胞中TLR2、3、4、7 和9、NOD1、NOD2 的表達。PR3-ANCA 可通過上調人單核細胞中的TLR 和NOD 信號通路，在各種微生物成分刺激后產生細胞因子，從而部分參與Wegener 肉 芽 腫 的 炎 癥 過 程［12］。NOD1 受 體 是NLRs 家族中發現的第一個細胞內PRR，自發現以來一直受到很多關注，主要是因為它在炎癥和免疫調節中起重要作用［13］。許多疾病的發病機制與NOD1 的參與密切相關［14-16］。MAJUMDAR 等［14］通過對比檢測促炎細胞因子IL8 和IL-1β的mRNA表達，發現NOD1 中的NBD 結構域內SNP 的功能及結構效應可能與潰瘍性結腸炎的易感性風險有關。NOD1 受體的激活通過與下游絲蘇氨酸酶RIP2 等相關信號蛋白結合，激活NF-κB 等信號通路，促進IL-6 等多種細胞因子的分泌，從而參與免疫反應［14，17］。PLANTINGA 等［18］發現在NOD1 +32656 插入等位基因的類風濕關節炎患者的細胞中促炎細胞因子產生增加，表明NOD1 多態性通過調節Toll 樣受體或NOD 樣受體配體誘導促炎細胞因子反應。KHARWAR 等［8］也通過病例對照分析發現，NOD1 的純合基因型（Lys/Lys）與格林-巴利綜合征（GBS）存在顯著相關，并且也增加了GBS兩種亞型的風險，因而發現其可能是GBS 遺傳易感性的標記。

表3 病例組患者NOD1 rs77890453 種基因型實驗室指標的比較分析Tab.3 Comparative analysis of laboratory indicators of NOD1 rs7789045A/Tthree genotypesin the case group M（P25，P75）

NOD1 是涉及炎癥過程的關鍵分子和治療方法的合適候選者，但其治療潛力僅被部分利用。而本文研究探討的AAV 作為一種累及多個器官系統的自身免疫性疾病，目前其病因和發病機制尚未完全闡明，且目前NOD1 在我國AAV 疾病的分子遺傳學方面尚缺乏研究，因此推測NOD1rs7789045 A/T 基因多態性是否可能與AAV 的發生發展有關。本研究使用病例對照分析方法，結果表明，正常人群與AAV 患者在NOD1 rs7789045 中均存在基因多態性，且在3 種基因型及等位基因的分布頻率上差異有統計學意義（P＜0.05），表明NOD1 rs7789045 基因多態性可能與AAV 患者的易感性相關。通過比較，發現與AA 基因型相比，攜帶AT、TT、AT+TT 基因型可能增加了AAV 的發病風險，OR值分別為（OR= 2.31，95%CI：1.14～4.67）、（OR= 2.49，95%CI：1.06～5.85）、（OR= 2.36，95%CI：1.21～4.61）；病例組與對照組A、T 等位基因分布差異有統計學意義（P＜0.05），與A 等位基因相比，T 等位基因可能增加了AAV 的發病風險，OR值為（OR= 1.61，95%CI：1.07～2.42）。這說明攜帶“T”等位基因可能在AAV 的發生發展中起相關作用。有學者發現，NOD1rs7789045TT 基因型通過與幽門螺桿菌的作用，使胃癌的患病風險增加，可能在促進中國人群中胃癌的發生起重要的作用［19］。在VITTORIO 等［20］的研究中，NOD1 的多態性導致了功能的改變，幽門螺桿菌與NOD1 受體之間相互作用，通過細胞質結構調節胃上皮細胞的免疫炎癥和增殖反應，從而影響了潛在病理相關改變的發生。本研究中，NOD1 rs7789045 的差異也存在于病例組與對照組之間，這一結果提示NOD1 rs7789045 風險等位基因“T”可能是參與AAV 發病機制的遺傳危險因素之一，但目前NOD1 基因多態性與AAV研究較少，這有待于進一步的研究來驗證。本研究的臨床癥狀資料顯示，AAV 患者臨床癥狀（發熱、皮疹、水腫、蛋白尿、關節痛）的發生率差異無統計學意義（P＞0.05），表明NOD1 rs7789045 A/T 基因多態性可能不影響AAV 患者的上述臨床表現。本研究實驗室資料結果顯示，AAV 患者各基因型之間的臨床癥狀（血白細胞、血紅蛋白、血尿素氮、血肌酐、血漿白蛋白）水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），說明NOD1 rs7789045 A/T 基因多態性可能不影響AAV 患者的上述實驗室資料水平。

隨著基因編輯技術的興起，它為生命醫學提供了新的方向，也為許多疾病的基因治療提供了新的方案［21-22］。例如，炎癥性疾病和自身免疫性疾病的治療雖然處于起步階段，但隨著技術的成熟，人們認為基于基因編輯的特異性治療無疑將提供新的病理生理學見解和治療［23-24］。本研究首次證明了NOD1 rs7789045 SNP 與廣西漢族人群AAV 的關系。本研究提示使用NOD1 rs7789045A /T 作為干預目標可能為AAV 提供新的治療方法，為進一步遺傳學研究提供依據。

綜上所述，NOD1 rs7789045 可能是廣西漢族人群中AAV 的易感基因位點。然而，由于樣本量小且地理位置有限，NOD1 rs7789045 基因多態性對AAV 的作用機制尚不能得到充分反映。上述結論需要通過擴大區域和樣本量來進一步驗證。希望基于NOD1 基因多態性的靶向干預策略的深入探索，NOD1 的研究發展將為AAV 的治療提供新的治療方法。