IL-10對體外培養胚胎大鼠中腦NSCs增殖分化的影響

嚴繼貴 (安徽醫學高等專科學校護理學部 藥學系，安徽 合肥 230601)

趙正梅，盛夕曼 (安徽醫學高等專科學校護理學部，安徽 合肥 230601)

楊宇清 (安徽醫學高等專科學校藥學系，安徽 合肥 230601)

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)具有無限增殖、分化及遷移的特性，既可直接用于干細胞移植，亦可作為基因治療的載體。目前，NSCs移植研究多集中于腦部疾病，移植的NSCs經增殖與分化后，補充、替換和修復死亡及損傷的腦細胞[1]，以期治愈腦部疾患。隨著研究的深入，研究者發現NSCs不僅具有神經再生、結構修補或替代、神經重塑、神經保護等作用[2～4]，其治療范圍亦不局限于腦損傷。有學者經蛛網膜下腔移植NSCs修復大鼠脊髓損傷及治療坐骨神經痛[5]，也就是說NSCs移植在治療神經病理性疼痛方面有一定作用。白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種抗炎因子，能有效減輕腦損傷的炎癥反應，既能為NSCs移植提供較好的微環境，又能減輕炎癥對神經病理性疼痛的刺激作用[6]。故本實驗將IL-10與胎鼠中腦NSCs共培養，體外觀察其對NSCs增殖與分化的影響，并通過免疫熒光法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、神經膠質酸性蛋白(GFAP)和神經元特異烯醇化酶(NSE)等相關指標，以探討其可能的作用機制，為后續應用IL-10-NSCs移植治療神經病理性疼痛等奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

孕14d清潔級Sprague-Dawley大鼠，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。重組人IL-10購自美國Promega公司，高糖DMEM/F12、特級胎牛血清(FBS)購自美國Hyclon公司，N2添加劑購自美國Gibco公司，堿性成纖維蛋白因子(basic-fibroblast growth factor，b-FGF)購自美國Sigma公司，兔抗caspase-3多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司(PR-0284)，抗nestin多克隆抗體購自美國Abcam公司(ab6142)，兔抗NSE多克隆抗體(bs-1027R)、兔抗GFAP多克隆抗體(bs-0199R)購自北京博奧森有限公司， FITC標記的兔抗大鼠多克隆抗體(BA1108)、Cy3標記的大鼠抗兔多克隆抗體(BA1032)購自武漢博士德生物工程有限公司。

恒溫二氧化碳培養箱購自德國WTCBinder公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠，GIS-2020凝膠圖像處理系統購自上海天能科技有限公司，倒置顯微鏡及成像系統(ECLIPSE Ts2)購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

實驗分4組：空白對照組；高劑量組：IL-10質量體積分數為100μg/L；中劑量組：IL-10質量體積分數為50μg /L；低劑量組：IL-10質量體積分數為10μg/L。

1.2.2 胎鼠中腦NSCs培養、傳代、分化

將孕14d的SD胎鼠中腦制成單細胞懸液，置于無血清培養基(含1%N2的DMEM/F12)中懸浮培養，種植密度為1×106/mL，隔天半量換液，每日按10ng/mL添加bFGF，余同中腦神經元培養。5d后用1mL移液器輕輕吹打10～15次，將懸液按800rpm離心8min。半量去上清，再吹打10～15次，行傳代培養。另在24孔培養板中鋪滿已包被多聚賴氨酸(poly-l-lycine，PLL)的蓋玻片，將剩余NSCs懸液移入其中，半量加入DMEM/F12分化液(含10%FBS)，24h后加入全量分化液，培養1周后行免疫熒光化學實驗。實驗組在增殖、傳代及分化培養中IL-10質量體積分數保持不變。

在倒置顯微鏡下觀察神經球的生長狀況，邊緣整齊否、有無光暈；臺盼藍染色觀察NSCs活力及傳代次數；誘導分化后神經球貼壁時間、分化狀況。

1.2.3 免疫熒光染色及圖像分析

每個指標，每組對應任取6孔細胞吸去培養基，PBS洗5min，連續洗3次。加入4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次(5min/次)后，用0.4%TritonX-100透膜10min，加入封閉液封閉15min，分別滴加一抗nestin(1∶400)、Caspase-3(1∶50)、NSE(1∶75)、 GFAP(1∶200)，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min；滴加FITC標記的兔抗大鼠多克隆抗體和Cy3標記的大鼠抗兔多克隆抗體，避光孵育1h，PBS洗3次(5min/次)，再用蒸餾水洗10min，甘油封片。每組取6張玻片，熒光顯微鏡下隨機取4個視野進行拍照，使用Image-Pro Plus專業圖像分析軟件分析神經球和陽性細胞的累積光密度值(IOD)值。

1.2.4 統計學分析

2 結果

2.1 NSCs培養、傳代及誘導分化

培養24h即見神經球，3d后其邊緣整齊晶瑩透亮，活力好(圖1(a))。傳代培養結果顯示，高、中劑量組NSCs可傳5代，高劑量組細胞活力(p5=67%)高于中劑量組(p5=51%)，另2組可傳3代。加入血清24h神經球貼壁，48h有分化細胞長出(圖1(b))，1周后高、中劑量組NSCs分化程度最高(圖1(c))，低劑量組次之，對照組最差。

2.2 加入IL-10促進NSCs增殖及向神經膠質細胞分化

免疫熒光結果顯示，神經球呈nestin陽性染色(圖1(d))，即表達NSCs特異性標記物nestin蛋白；IL-10質量體積分數為100μg/L的高劑量組神經球nestin表達量最大(1943574.61±324851.45)，與中、低劑量組及對照組相比，有統計學差異(P<0.05)；IL-10質量體積分數為50μg/L的中劑量組(1122378.63±553472.08)和IL-10質量體積分數為10μg/L低劑量組(1087813.92±534776.30)神經球nestin表達量無統計學差異(P>0.05)，但2組分別與對照組(490071.02±181824.56)相比，均有統計學差異(P<0.05)(見表1)。加入IL-10后，體外培養的胎鼠大鼠中腦NSCs增殖顯著。凋亡基因蛋白Caspase-3的表達以對照組(2351253.00±101321.54，與其他3組相比作用最強(圖2(d))，高劑量組與中劑量組相比，無統計學差異(P>0.05)(見圖2(a)、(b))，低劑量組Caspase-3的表達(1325947.90±181482.68)與其余3組相比，有統計學差異(P<0.05)(見表1、圖2(c))。高、中、低劑量組NSCs增多可能與抑制凋亡基因Caspase-3表達有關，其機制可能是加入IL-10后，通過某種特定路徑抑制了Caspase-3的表達。

注： (a)原代培養3d的神經球；(b)貼壁培養48h的神經球；(c)貼壁培養1周后高、中劑量組NSCs分化程度最高；(d)呈nestin染色陽性的神經球。Bars=50μm in (a～d)。圖1 各組NSCS體外培養和分化

組別Nestin/1 Caspase-3 /1對照組490071.02±181824.562351253.00±101321.54高劑量組1943574.61±324851.45a848715.63±64934.77a中劑量組1122378.63±553472.08ab935672.52±403184.70a低劑量組1087813.92±534776.30ab1325947.90±181482.68abc

注：與對照組比較，aP<0.05；與高劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

注： (a)高劑量組Caspase-3表達很弱；(b) 中劑量組Caspase-3表達亦很弱；(c) 低劑量組Caspase-3表達較強；(d)對照組Caspase-3表達最強。Bars=50μm in (a～d)。圖2 各組凋亡基因蛋白Caspase-3的表達

GFAP染色顯示，高劑量組表達最強(103343478.30±11652062.31)(見圖3(a))，中劑量組次之(79390065.33±12071396.27)(見圖3(b))，低劑量組較弱(49261482.33±17002176.95)(見圖3(c))，對照組最弱(21470592.54±10412377.04)(見圖3(d))，各組比較均有統計學差異(P<0.05)(見表2)。加入IL-10后，可促進體外培養的胎鼠大鼠NSCs向神經膠質細胞分化，并呈濃度依賴性。由表2及圖4可以看出，各組NSE染色并無統計學差異(P>0.05)。加入IL-10后，對體外培養的胎鼠大鼠NSCs向神經元方向分化無明顯影響。

注： (a) 高劑量組GFAP表達最強；(b) 中劑量組GFAP表達較強；(c) 低劑量組GFAP表達較弱(d)對照組GFAP表達最弱。Bars=50μm in (a～d)。圖3 各組GFAP表達情況

表2 各組神經球分化后GFAP、NSE陽性細胞IOD值比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與高劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

注： (a) 高劑量組、(b) 中劑量組、(c) 低劑量組、(d)對照組NSE陽性染色細胞無統計學差異。Bars=50μm in (a～d)。圖4 各組NSE陽性染色細胞

3 討論

神經干細胞是神經系統的始祖細胞，具有無限增殖、分化、遷移、趨化和低免疫原的生物特性[7]。干細胞的多潛能和自我更新特性賦予其在缺血、變性條件下以及創傷中再生丟失組織的能力，以幫助減輕腦損傷及改善腦損傷后的功能[8, 9]。研究表明，移植誘導分化的神經干細胞的治療效果優于直接移植未經分化的神經干細胞，經誘導分化為不同階段的神經細胞再用于移植時，可顯著降低成瘤風險[10～13]。目前，NSCs的應用不僅僅局限于移植治療腦損傷疾患，Sacco等[14]認為通過移植NSCs有可能治愈神經精神類疾病，并推測神經發育障礙的原因是NSCs增殖與分化的失衡所致。Ebrahim等[15]將體細胞重新編程轉化，誘導出所需NSCs，利用直接轉化/轉分化過程，繞過多能狀態，從而減少腫瘤發生和遺傳不穩定的風險。盡管如此，NSCs的臨床應用仍面臨諸多難題，如何調控NSCs增殖，如何誘導NSCs定向分化成目標細胞，如何減輕腦損傷導致的炎癥反應對移植NSCs造成的影響等。

IL-10是Ⅱ型輔助T細胞分泌的細胞因子，不僅在免疫調節中起重要作用，還是調節巨噬細胞分泌的主要因子[16]。當中樞神經損傷時，IL-10能降低過度而有害的免疫應答，并能激活浸潤的巨噬細胞，削弱膠質瘢痕生長，促進受損的神經細胞修復[17]。而IL-10基因敲除的大鼠在永久性大腦中動脈梗死后死亡率明顯增加[18]。因此，眾多學者在研究NSCs移植時想方設法提高IL-10的分泌水平，以減輕腦損傷的炎癥反應，從而創造出利于移植NSCs增殖分化的微環境。Zhang等[19]將NSCs與IL-10制成混懸液進行移植，以降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。Xu等[20]將NSCs誘導分化成神經元，并加入白細胞抑制因子(LIF)，通過激活PI3K/Akt信號途徑，促進IL-10分泌，從而改善神經元的存活。可見，在NSCs移植應用研究中IL-10愈來愈受到重視。筆者將IL-10與NSCs共培養，通過檢測NSCs、神經元和神經膠質細胞的特異性標記物nestin、NSE和GFAP來觀察其增殖及分化情況。另外凋亡基因Caspase-3表達量的比較可以判斷凋亡對NSCs存活率的影響[21]。結果表明，IL-10能顯著促進NSCs增殖，一方面與其內在的分子機制相關，另一方面可能與抑制Caspase-3表達相關，減少了NSCs凋亡的發生。同時，IL-10能促進NSCs向神經膠質細胞分化，但對其向神經元方向分化作用不顯。

綜上所述，IL-10不僅能減輕腦損傷的炎癥反應，為移植NSCs創造有利的微環境，還能促進NSCs增殖，并影響NSCs的分化。下一步將構建表達IL-10的NSCs，進行體內移植，并進一步研究IL-10 影響NSCs增殖分化的具體分子機制，為后續應用IL-10-NSCs移植治療神經病理性疼痛提供實驗依據。