腎上腺素對于心室乳頭肌細胞復極化過程中主要離子通道的調節作用

張波軒,李 倩，賈慶忠

(河北醫科大學藥理教研室，教育部神經與血管生物重點實驗，河北省新藥藥理毒理研究重點實驗室，河北省新藥安全評價研究中心，河北 石家莊 050017)

心肌離子通道是產生動作電位的基礎，一般情況下，心肌細胞在靜息狀態時接受有效刺激，迅速產生動作電位，引發收縮效應。本文以心室乳頭肌細胞為例，分析心肌細胞的動作電位，心室乳頭肌細胞的動作電位具體分為以下幾個時相，如Fig 1所示。

1 動作電位各時相以及參與的離子通道

0相：細胞膜除極化，鈉離子INa(Nav1.5)或鈣離子進入細胞，靜息膜電位發生快速變化，從-90～+30 mV。1相：激活了短暫的外流復極鉀離子流Ito(Ito.f,Kv4.2/4.3;Ito.s, Kv1.4/1.7/3.4)。2相：動作電位的平臺期，由于多種電流成分同時發揮作用，較為重要是L-型鈣通道激活引起的內向電流ICa,L(Cav1.2)，與Ikr和Iks鉀通道激活產生的外向電流抵消。3相：復極期，外向鉀電流包括延遲整流電流Ikr(Kv11.1,hERG)和Iks(Kv7.1,KvLQT)與部分內向整流鉀通道電流Iki(Ik1,Kir2.1/2.2；IK,ATP,Kir6.2)的增強以及ICa,L電流的關閉，促進膜的快速復極。4相：舒張期，3相激活的內向整流鉀通道以及雙孔鉀通道Ikp(TASK、TWIK、TREK)維持靜息膜電位-90 mV左右，對于自律細胞還伴隨超級化激活的陽離子通道電流If或Ih(HCN2/4)的激活，以及鈉-鈣交換體(sodium-calcium exchanger，NCX)使生電作用增強，導致細胞膜除極和重啟動作電位(Fig 1)。

Fig 1 Action potential phase and participating ion channels

上述離子通道功能異常會引起心律失常，當Na+通道阻滯時，進入細胞的INa減小，使動作電位時程延長，引起折返性心律失常。當出現持續的Na+內流時，鈉-鈣交換增加，細胞內的鈣離子濃度增高，導致后除極和快速性心律失常。Ikr電流受阻滯時，動作電位時程會延長，會誘發尖端扭轉型室性心動過速。Iks減弱，導致QT間期延長，引起致命性室性心律失常。同樣，Iks增強，導致QT間期縮短，也會引發心律失常。心肌細胞Ca2+流異常，導致鈣穩態失衡，引起延遲后除極。L型鈣通道電流被抑制會導致竇性停搏、竇房阻滯和房室傳導阻滯[1]。

有潛在心肌缺血、心衰、心絞痛或者伴有心肌離子通道病變時，遇到情緒激動、應激狀況，交感張力異常增高，或者使用外源性腎上腺素，如過敏性休克[2]以及與局麻藥物合用[3]，體內兒茶酚胺類物質升高，會誘發快速型心律失常，甚至出現室顫或猝死情況。主要原因是心肌離子通道功能調節發生異常，導致心肌自律性提高、后除極及觸發活動增加、傳導異常伴隨折返活動、心肌除極或復極化程度不一致。反映在心肌動作電位上的變化主要體現在以下幾方面[4]：最大舒張電位、閾電位水平以及4相自動除極速率發生改變并影響到心肌自律性；復極時間過長、鈣內流較多誘發后除極和觸發活動；改變膜反應性和傳導性引發折返激動； 有效不應期(effective refractory period，ERP)與動作電位時程(action potential duration，APD)比值大小影響到心肌細胞均一性。總之，上述一種或多種離子通道的異常均有可能導致心律失常。

腎上腺素作為一種重要的兒茶酚胺類神經遞質和急救藥物，對心臟的調節作用復雜，這可能與它對α和β受體選擇性不同[5]，涉及的信號轉導通路有別有關。有研究表明，腎上腺素低濃度(10-7mol·L-1)可延長動作電位時程，高濃度(10-5mol·L-1)可以縮短動作電位時程[6]，甚至有人提出，不同濃度的腎上腺素可用來預測長Q-T間期綜合征(long Q-T syndrome，LQTS)綜合征患者突發致死性心臟病的風險[7]。因此，研究腎上腺素受體激活后的信號轉導過程，分析腎上腺素對復極過程中主要離子通道的調節作用，以期加深對兒茶酚胺類物質引發室性心律失常的分子機制認識。

2 腎上腺素激活的受體類型及相偶聯的信號轉導途徑

腎上腺素受體是典型的G蛋白偶聯受體，分為α受體和β受體兩類，α受體又分α1、α2受體，β受體分為β1、β2、β3受體。腎上腺素對β受體親和力比α受體強，所以低濃度時以β效應占主導，高濃度α受體效應為主。腎上腺素β1受體激活可影響Gs-AC-cAMP-PKA-L-Ca2+信號通路，即β1受體激活后，與Gαs蛋白偶聯，激活腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)，導致cAMP增多，依賴cAMP的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA，PKA)活性增強，導致心肌細胞上的通道蛋白磷酸化，促進心肌鈣轉運，心肌收縮性增強，發揮正性變力、變時調節作用(Fig 2)。β2受體在蒲肯野纖維和竇房結有較高的分布，主要作用是參與心律調節。β2受體除了可以通過經典的Gs途徑外，還可以通過Gi途徑激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)、ERK途徑，發揮轉錄調節作用。β3受體與Gαs和Gαi型G蛋白偶聯，更多地表現出Gi蛋白激活、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活化、細胞內環磷酸鳥苷水平增加，顯示負性肌力調節作用。β受體，特別是β2亞型很容易脫敏，主要原因是由于G蛋白偶聯受體激酶( G protein-coupled receptor kinases，GRKs)將受體磷酸化后，與抑制性蛋白β-arrestin結合，促進了受體內吞[8]。腎上腺素作用的α受體可分α1和α2兩個亞型，以激動α1(α1A、α1B、α1D)受體亞型為主，可激活Gq-PLC-PIP2-IP3/DAG-Ca2+/PKC信號通路。正常情況下，心臟α1受體約占心肌腎上腺素受體總量的10%，β受體約占90%。心衰時，α1受體會上調，因此，在病理情況下，α1受體支配作用會增強。刺激心臟α1受體可以產生正性肌力作用，不同于β受體的強效快速作用，α1受體產生的收縮作用緩慢。這主要是由于α1受體與Gq蛋白偶聯，α1受體激活引起細胞膜內效應器酶—磷脂酶C(phospholipase C，PLC)活化，磷脂酰二磷酸肌醇(phosphatidylinositol diphosphate，PIP2)水解成三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二酰甘油(diacylglycerol，DG)。IP3和DG作為第二信使，在細胞內發揮信息傳遞作用，IP3首先與內質網外膜上的Ca2+通道結合，使內質網釋放鈣離子入胞質，導致胞質內鈣離子濃度明顯增加，鈣離子與細胞內鈣調蛋白(calmodulin， CaM)結合，激活下游靶蛋白，進而調節細胞的功能活動。DG也可以通過激活PKC，進一步磷酸化離子通道，調節細胞生理病理變化[9]轉導途徑見Fig 3。α2(α2A、α2B、α2C)受體與Gi/o型G蛋白偶聯，主要分布于支配心肌的神經突觸前膜及神經節上，對遞質分泌起重要調控作用。

Fig 2 Regulation of β receptor

Fig 3 Regulation of α1 receptor

3 對L-型鈣通道及ICa,L電流的調節作用

L-型鈣通道是心肌細胞動作電位形成平臺期的主要離子通道，與細胞內鈣離子濃度密切相關，影響著心肌收縮力。腎上腺素一個非常明確的作用就是經由cAMP/PKA，磷酸化L-Ca2+通道的α亞基羧基端，增加ICa,L電流，其中激動心肌β1受體可產生一個可擴散的cAMP的升高，而激動β2受體由于與Gs和Gi的雙向偶聯，主要由于β2R、Gαs、AC、PKA與L-Ca2+通道形成的大分子信號復合體位于小窩內，僅形成或引起較為局限的L-Ca2+通道的激活效應[10]。所以腎上腺素激活β受體，無論是β1還是β2，引起的鈣內流都是導致心肌收縮、形成動作電位2相平臺期重要原因，也是延長APD的一個主要參考因素。

激活α1受體后對L-Ca2+通道的影響一直是很有爭議，一方面，有文獻報道，α1受體激活可以抑制ICa,L電流，主要通過PKC對L-Ca2+通道磷酸化實現，這一作用可部分拮抗β受體激活引起的胞內鈣升高效應[11]。另有一種報道認為，用苯腎上腺素激活α1受體雖然可以引起心肌正性肌力作用，但與緩慢鈣內流并沒有關系[12]。也有報道，在新生大鼠心室肌細胞上激活α1受體可引起L-Ca2+通道電流增強。近期隨著對α1受體亞型分類的研究的不斷深入，認為α1受體增強ICa,L電流作用是通過α1A受體激活Gq/11-PLC-DAG-PKC-CaMKII途徑實現；抑制ICa,L電流效應是通過α1B受體激活-Go型G蛋白生成的Gβγ直接對L-Ca2+通道的調節作用[8]。還有一種可能是與心肌PKC亞型種類和分布不同調節作用有關[13]。目前，雖然α1受體對L-Ca2+通道調節作用的詳細機制仍不清楚，但是用苯腎上腺素激活α1受體后，使心室肌細胞的APD延長現象卻比較肯定，分析原因除了L-Ca2+通道調節參與之外，還應該與調節3相復極化鉀通道有關。

4 對KCNQ1通道及Iks電流的調節作用

心室肌3相復極化過程中Iks電流是引起快速復極的主要外向離子流，它是由KCNQ1與輔助亞基KCNE1構成。腎上腺素激活α1受體，通過PLC水解會導致心肌Iks電流的直接抑制，這種抑制效應在KCNQ1通道基因突變(R174C, R243C, R366Q和R555C)的患者上表現會更明顯，導致病人交感神經輕微波動，就會引發LQT1綜合征。其中一個重要原因是突變導致KCNQ1通道與PIP2親和力減弱，通道電流減小，受體激活時，引起PIP2水解對通道電流抑制作用更敏感，心肌復極化時程明顯延長，誘發室性心律失常[14]。

激動β1受體對Iks電流最主要的影響，主要是通過Gαs-AC-cAMP-PKA途徑磷酸化KCNQ1/KCNE1通道蛋白，使Iks電流增強[15]。當然除了PKA之外，α1受體激活Gq/11-PLC-PIP2-DG途徑激活PKC，也可以將KCNQ1/KCNE1通道磷酸化，在一定程度上也會增強Iks電流。這種由PKA或PKC介導的增強Iks電流的作用機制復雜，涉及通道動力學改變、與PIP2的親和力、以及通道蛋白在膜上表達變化。總之，腎上腺素通過激活β1受體促進Iks鉀離子外流的作用，在一定程度上可以抵消L-Ca2+通道開放導致的鈣內流，加之Iks電流具有慢激活和慢失活特征，隨時間推移加上hERG通道開放，共同促進鉀外流作用明顯增強，形成了3相快速復極。由此看來，腎上腺素導致的心肌APD縮短，其關鍵因素與其通過PKA/PKC途徑，增強Iks電流的調節作用分不開[16]。

5 對hERG通道及Ikr電流的調節作用

延遲整流鉀電流Ikr是復極化過程中又一個主要外向離子流，是由α亞基(hERG基因編碼)與β亞基(minK或 MiRP1)共同構成。腎上腺素激動α受體(主要為α1A受體)可以抑制hERG電流，并且使通道激活曲線向去極化方向位移，其機制與PLC水解PIP2有直接關系[17]。除此之外，α受體激活還可以通過DAG-PKC途徑調節該通道，研究結果提示，PKC磷酸化參與該通道調節，而且不同亞型的PKC對通道有特異性抑制途徑[18]。

β受體對hERG通道調節頗有爭議，Heath等[19]研究認為，異丙腎上腺素激活β受體可以減少通道C-型失活，增強hERG電流。Karle等[20]的研究認為會抑制hERG通道電流，機制是因為胞內Gs-AC-cAMP激活PKA，磷酸化hERG通道所致。與PKA抑制作用相對應的是，cAMP與hERG通道C端有一段cNBD(cyclic nucleotide binding domain)序列可以結合，在一定程度上可減弱這種調節效應，而且后來發現，輔助亞基minK和hMiRP1也參與了β1受體激活導致的PKA依賴性的調節。近期有報道，β-arrestin參與介導了hERG通道電流的增加作用，這樣使得β受體的調節hERG通道的作用變得更加復雜，機制研究還會進一步深入。

比較腎上腺素對Iks和Ikr電流調節的異同，不難發現，無論通過PIP2水解還是PKC的磷酸化，對hERG通道調節作用結果是一致的，均會導致抑制效應。其實臨床還有很多藥物，如抗心律失常藥、喹諾酮類抗菌藥、抗癌藥、抗組胺藥等，會對hERG通道有不同程度的阻滯，還有部分人群該基因突變后通道功能下調，諸多因素的作用會導致3相復極化時程相對延長，誘發LQT2綜合征，嚴重時還會發生尖端扭轉性室性心動過速，甚至心源性猝死。所以近些年關于對hERG通道調控研究很熱，包括一些藥物篩選時，考慮其潛在致心律失常風險，首先要排除對hERG通道的影響。

6 對Kv4通道及Ito電流的調節作用

瞬時外向鉀電流Ito由快成分Ito,f和慢成分Ito,s構成，是心肌I相復極化的主要離子通道，其中快成分Ito,f主要是由Kv4.2/4.3編碼α亞基與KChIP2為主的多種β亞基(如KChIP1、KChIP3、MiRP、Mink、DPP10)等共同構成，有電壓依賴性特征，是復極I期主要電流，主要表達在心外膜，編碼慢成分Ito,s的α亞基是Kv1.4/1.7構成，它可由肌漿中Ca2+激活，主要表達在心內膜。由于Kv4.3通道的表達都呈現出跨心肌膜梯度差異，這一特性被認為是心臟跨心肌膜電生理差異性的結構基礎，在各種心臟疾病，如心肌梗死、心力衰竭中，Kv4.3通道表達或功能改變導致的早期復極化異常，被認為是各種惡性心律失常的致病原因，尤其是一種遺傳性心律失常疾病Brugada綜合征，主要是因為KV4.3通道上發現了兩個氨基酸點突變(G600R和L450F)，導致快速瞬時外向鉀電流增大，進而引起動作電位穹頂的穩定消失，在心電圖上表現為ST段特征性異常改變。目前，認為α腎上腺素能受體可以通過PKC途徑磷酸化Kv4.3，抑制通道電流[21]，并且這個過程受β亞基控制和調節，而且這種調節僅局限于小窩蛋白(脂筏一種)的通道和受體。對于β腎上腺受體對Ito電流的調節，Po等[21]報道，β1受體可以通過Ca2+-CaMK-NFκB途徑產生抑制作用，而Gallego等[22]認為，通過β2受體提高Kv4.2和Kv4.3在膜上表達，增強通道電流，調節途徑是通過Arrestin-cSrc-Ras-MEK1/2-ERK1/2信號通路，以及MAPK級聯調節來實現，其它更詳細的作用機制并不是很清楚。由于Ito在不同種屬表達差異較大，在生長的不同時期也有很大差異，主要原因與β亞基多樣性調節有關，這增加了研究的難度，但是，Ito電流的抑制或增強，均會對復極早期產生明顯影響，尤其是2相復極的離子通道功能影響明顯。例如，長期交感張力增高導致去甲腎上腺素釋放增多，因α受體長期活化對Ito形成的抑制，會抬高2相平臺期膜電位，導致ICa,L內流增多，成為心肌病變的重要機制之一[23]。

7 對Kir2.1/2.2和Kir6.2通道及Iki電流的調節作用

心肌內向整流鉀通道(IK1通道)是維持和穩定心肌靜息電位最重要的離子通道，也是參與動作電位復極后期重要的離子通道，人的心室肌中記錄的Iki電流主要Kir2.1和Kir2.2構成的同源及/或異源四聚體通道電流，以及Kir6.2和SUR2A(輔助亞基，磺酰脲類受體)構成的IK,ATP電流構成。α1受體激活引起的PIP2水解可導致Iki電流抑制，包括Kir2.1、Kir2.2、Kir6.2各種亞型，主要原理是因為PIP2分子中帶負電的頭部與各類通道中帶正電的氨基酸殘基之間的靜電作用，各種激酶，無論是PKC，還是PKA，對Iki電流，多數是影響了PIP2合成或與通道的親和力[24]。激活PKC(PKCβ亞型)對Kir2.1/2.2通道磷酸化可以形成電流抑制，PKC還可以使通道內化抑制KATP電流。腎上腺素β受體對IK1通道電流的調節主要通過PKA實現，可以通過PKA-AKAPs途徑實現對Kir2.1/2.2的抑制，然而，β3亞型卻可以通過PKA激活Kir2.2亞型，通過PKC激活Kir2.1，因此，β受體對IK1電流調節具有多樣性。

8 總結

綜上所述，在心室肌復極化過程中，Ito、ICa,L、Ikr、Iks、IK1均是構成動作電位復極化的主要通道電流，交感神經興奮釋放的兒茶酚胺類物質，均可以通過α和β受體影響上述離子通道。α受體主要的調節途徑包括：通過PLC調節細胞膜磷酯(PIP2)代謝導致的抑制作用，影響最明顯的是對KCNQ1、hERG和Kir2通道，分別導致Iks、Ikr、IK1電流抑制；通過DAG-PKC途徑對通道蘇氨酸和絲氨酸殘基的磷酸化，通常會導致Ito、Ikr、IK1電流抑制，導致Iks電流增強。隨著對α受體亞型傳導信號通路認識的不斷加深，對通道調節的細節機制引起更多關注，例如，α1A亞型激活后產生Gβγ可以與很多離子通道產生直接作用。β受體在心室肌上主要為β1亞型占絕對優勢，并由cAMP-PKA磷酸化途徑介導了ICa,L和Iks電流增強效應。目前，針對β1受體對Ito和Ikr調節細節雖然還不是很清楚，甚至有些不一致，主要的原因可能是因為PKA途徑升高胞內鈣的現象非常明確，尤其是在正常的心肌生理活動中發揮重要調節作用，這也可能掩蓋了其生理狀態下對Ito和Ikr的調節作用。因此，研究病理狀態下β受體對Ito和Ikr調節作用可能會更有意義。

分析腎上腺素對動作電位影響，也離不開α和β受體對上述離子通道功能調節的研究，動作電位是很多離子通道綜合作用的體現，因此，在分析腎上腺素對APD影響時，也要綜合對各離子通道調節規律進行綜合分析。很長一段時間，人們對腎上腺素是縮短還是延長APD爭議不斷，主要還是因為動物種屬不同、組織不同、條件不同可能產生不一樣的結果，主要是因為離子通道調節機制的豐富多樣性所導致。總的來說，低濃度時(10-7mol·L-1)可使豚鼠心室乳頭肌動作電位時程(APD)延長，高濃度(10-5mol·L-1)使APD縮短[25]。而APD的延長效應在相對較低的外鈣濃度下(0.6～1.2 mmol·L-1)明顯，隨著外鈣濃度增高(>1.2 mmol·L-1)，這種延長效果就被高鈣所導致的縮短效應所掩蓋。高濃度腎上腺素(10-5mol·L-1)對APD的影響表現出雙相的，先短暫延長，而后長時間縮短的效應。其實，腎上腺素對APD的作用還不只是受外鈣的影響，還受到刺激頻率和峰張力影響，在一定范圍內，增加刺激頻率會使APD延長，相反會縮短；在刺激頻率固定隨著峰張力增加，APD逐漸縮短。通過對離子通道調節機制的分析，不難看出腎上腺素延長動作電位時程的影響，主要還是促進了ICa,L電流或抑制了外向鉀電流(Ito、Ikr、IK1)所導致，縮短APD的作用主要是促進了鉀外流(包括所導致Iks、Ikr)所致，或者是ICa,L電流的抑制作用。

(致謝：感謝河北醫科大學藥理教研室許彥芳教授給予的指導。)