中性粒細胞胞外誘捕網檢測方法綜述

王玉婷，顧 兵，李華南，余兆仲

(1. 江西科技師范大學藥學院，江西 南昌 330013；2. 江西中醫藥大學附屬醫院骨傷三科，江西 南昌 330006)

中性粒細胞受到多種刺激因子如白細胞介素-8、脂多糖[1]、鎳及致病菌等刺激后，通過吞噬、脫顆粒、活性氧爆發等一系列過程會產生DNA-蛋白質網狀結構參與清除病原體。這種由中性粒細胞產生的復雜網狀結構被稱為中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs一方面在病灶部位募集相關蛋白酶，如中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophilelastase，NE)，髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)等包裹病原體；另一方面通過激活多種調節信號阻斷外來致病菌的擴散和轉移。網狀結構最后由巨噬細胞吞噬代謝，未被吞噬的可以在核膜酸酶的作用下快速降解完成免疫反應[2]。但是，術后NETs擴散可能導致結腸癌的復發和凝血系統的紊亂[3]，逃逸降解的NETs積聚還會引發機體的排斥反應。因此，NETs作為機體多種免疫炎性疾病、血栓、癌癥等病理生理過程的重要參與者和標志物，檢測其濃度具有重要臨床意義。本文從成網標記物著手，對應用現有技術測定循環游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)和酶蛋白類(NE、MPO)濃度來量化NETs的方法進行系統綜述(Tab 1)，為后續研究提供參考。

Tab 1 Profile of detection methods for neutrophil extracellular traps (NETs)

1 cfDNA/ NETs檢測法

cfDNA是雙鏈和高度碎裂的DNA，90%存在有低分子量帶(150～180 bp)。Volckmar等[4]根據10 μL血漿中的DNA就能檢測到胎兒Y染色體序列證實臨床上整個病原體的刺激比實驗中單一因素刺激產生更多的cfDNA。cfDNA和組蛋白作為NETs的關鍵組成部分，能激活免疫應答幫助宿主對抗感染性和非感染性炎癥[5]。然而，它們也可能通過觸發凝血、炎癥、細胞死亡和損害纖溶而引發副作用[6]。所以，cfDNA/NETs是評價機體感染程度的新指標。除此之外，樣品中雙鏈DNA(dsDNA)的數量也可以間接表示NETs的量[7]。雖然不能排除其他形式細胞死亡產生dsDNA的干擾，但是，實驗血清中其他方式產生的dsDNA量與網捕死亡產生的量相比所占比例較低，該方法依然有效。

1.1 熒光染色法根據特定波長下熒光強度與DNA含量呈正相關的原理，人們通過熒光酶標儀檢測熒光染料與DNA特異性結合的熒光強度，來反映DNA數量的方法統稱為熒光染色法。繼2004年Brinkmann等[8]在熒光染色細胞上清液中的cfDNA，首次揭示了NETs 是中性粒細胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種網狀結構，奠定了染色法在NETs檢測中的重要地位。2008年Margraf等[9]選擇綠色熒光染料(Picogreen，分子探針)作為DNA結合物，在485nm波長處的發射熒光下快速檢測cfDNA，證明cfDNA/ NETs可診斷或預測創傷后并發癥。部分國內學者采用Picogreen熒光染色結合Pearson或Spearman相關性分析和t檢驗數據共同分析血清中dsDNA含量，提高數據可靠性。此外，后續實驗中多用Sytox green染色后，在激發光485 nm，發射光535 nm條件下立即讀取熒光數，以減少由于時間過長造成DNA樣品反應過度的可能，使量化結果更準確[10]。熒光染色法操作方便適用范圍廣，但是cfDNA分子量小，雜質標記物的篩選困難，設置相應的陰性對照排除非特異性結合的雜質是實驗不可或缺的一部分。

1.2 免疫組化和共聚焦顯微鏡法在免疫組化過程中，顯色劑標記特異抗體，激光共聚焦顯微鏡跟蹤掃描活細胞組織或切片，可得到NETs不同層面的高分辨率光切圖像。在細胞骨架、細胞膜、細胞器、染色體的三維成像方面表現突出。Chatfield等[11]模擬人痛風性關節炎患者滑液中NETs狀態并標記DNA，發現MSU誘導的中性粒細胞“自殺”性死亡形式-NETosis不同于佛波酯(PMA)或念珠菌誘導的NETosis和其他形式的細胞死亡(包括壞死性凋亡)。與熒光儀檢測相比，免疫組化和激光共聚焦法能捕捉到更精細的網狀結構。Shimomura等[12]用經典的DAPI染色DNA，分析共聚焦顯微鏡下DNA圖像灰度評估NETs形成狀況，計算NETs和總嗜中性粒細胞數量，并由此發現2 mg·L-1的重組人可溶性血栓調節蛋白足以阻斷LPS和活化的血小板與中性粒細胞相互作用形成NETs。該實驗優點是三維電鏡技術的參與擴展了鏡檢的橫向維度和清晰度，輕松實現組化染色后NETs圖像篩選。缺點是操作步驟繁瑣，僅能檢測已知特異性抗體的組織結構，且洗滌過程易洗掉NETs，需結合單因素或雙因素方差分析法增加可行性[13]。另外，人工處理核邊界部分時，容易受到主觀臆測的干擾。這和Hamilton等早期報道的所有定量方法無論以何種形式，都有各自的局限性觀點相一致。

2 蛋白酶/NETs檢測法

NE和MPO位于中性粒細胞的嗜苯胺藍顆粒上，能裂解組蛋白，參與染色質的去致密化過程，該過程是NETs形成初期的重要環節。在膿毒癥[14]和冠心病[15]等慢性炎癥患者的長期監測過程中，炎癥患者體內MPO和NE都會有不同程度的升高。而抑制HMG-CoA還原酶活性的他汀類降脂藥可減少NE釋放，調節炎癥轉歸過程。因此，定量檢測蛋白酶類炎性標志物是有效判斷NETs的形成狀態的新一輪研究方向。

2.1 中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的檢測

2.1.1蛋白質印跡法 該法是繼DNA印跡和RNA印跡之后發展起來的一種新的蛋白檢測技術，主要過程包括電泳、轉膜和免疫性標記。根據NE由267個氨基酸組成，分子質量為28～31 ku，蔣靜等采用60 V恒壓電泳，轉膜后5%脫脂奶粉封閉，再孵育、洗膜的方法得到NE蛋白表達結果。與ELISA測定的NE含量作對照，表示肝素可下調膿毒癥患者病變部位NETs水平，起到保護機體的作用。Papayannopoulos等[16]分析印跡結果顯示NETs組分純度，確定了NE可促進染色質濃縮的新機制。除此之外，Shapiro等[17]還發現NETs對大多數細胞外基質底物具有強催化活性，而缺乏NE時，小鼠對香煙煙霧表現出一定的抗性。免疫印跡法優點是可以從蛋白表達方面解析NE的定性和半定量問題。缺點是費時，變量多，蛋白樣品的制備直接決定整個實驗的成功與否，如：①蛋白酶樣品處理不當導致直接降解或表達；②裂解液、緩沖液和蛋白酶抑制劑配比錯誤；③蛋白濃度測定試劑盒選擇錯誤或標準曲線測定不準確。

2.1.2微孔板顯色法 該法以微孔為載體，基于樣品與底物的特異性反應，借助微孔板檢測儀反映樣品濃度。常用Alamar blue和特定氨基酸底物作底物篩選抗菌藥抑制劑和微量蛋白，具有快速靈敏的特點。微孔板根據用途分為酶標板、細胞培養板和高通量篩選板。Mitroulis等[18]從急性痛風期患者滑膜液提取的中性粒細胞六孔板培養，捕捉每孔NETs的熒光圖像，相當于同時獲得多個獨立的實驗結果，便于比較分析。另外，早在1974年就有學者發現NE對有機溶劑的敏感性較高，所以Kunder等延用前人方法，以琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-丙氨酰-對硝基苯胺作為反應底物進行顯色試驗。近期，Karandashova等[19]根據NE發揮催化作用中心之一的Ser殘基上連有羥基，易與Ala(丙氨酸)、Met(蛋氨酸)、Leu(亮氨酸)、Val(纈氨酸)等不帶電的小分子氨基酸結合的特點，改用琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-對硝基苯胺作為底物進行微量滴定板滴定，更準確的確定了NE濃度，并證明其變化與總鞘脂、神經酰胺含量呈線性相關。總的來說，微孔板顯色試驗將微量蛋白的特異性反應和快速檢測手段相結合，具有樣品用量少，平行度和穩定度高的特點。不足之處是樣本量過少時，受單個數值影響明顯。

2.2 髓過氧化物酶(MPO)的檢測

2.2.1酶聯免疫吸附法 臨床上常應用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測外周血清中抗體、抗原、激素和微生物等表達情況。Metzler等[20]用PMA處理中性粒細胞，分時間段裂解后離心獲得含可溶性蛋白的胞質溶膠。首先，ELISA監測NE 120 min后，NE會從胞質溶膠移位到細胞核。其次，在免疫組化的基礎上，選用膠體金作為示蹤劑標記MPO和NE，透射顯微鏡檢查，通過電子顯微照片，在細胞膜和腔中完成MPO和NE的定位。此處ELISA結合免疫組化雖然提高了MPO選擇性和敏感性，但是不構成蛋白質結合度和密度的定量評估。Nizam等[21]對牙周炎患者組和健康人群組的唾液、MPO、NE血清濃度進行ELISA測定，確定全身性慢性牙周炎的生化數據。考慮到臨床收集的中性粒細胞存在多重結構狀態，取樣也具有隨機性，更多研究者體外刺激中性粒細胞形成NETs。此外，抗原抗體結合的環境不適會增加背景，影響結果判定[22]。因此，Franck等以新鮮馬血為研究對象，稀釋血清減少MPO和樣品環境中其它生物分子之間的相互作用，同時改良MPO和初級抗體之間的結合方式，實現了MPO濃度測定的初衷。除了重復性差，該方法靈敏、快速且成本低可實現自動化，成為檢測早期免疫炎性疾病病情及預后效果中重要指標NETs的優先方案。

2.2.2流式細胞法 流式細胞術(flow cytometry)標記樣品液相通過流式細胞儀，可高速分選亞細胞及細胞內顆粒物(DNA、RNA及蛋白質等)。Bekeschus等[23]流式細胞儀的陽性染色結果證實，MPO存在于傷口處的中性粒細胞內，而傷口溶液中存在NETs。Gavillet等[24]同時檢測MPO和組蛋白，確定血液樣品中的NETs狀態。Masuda等[25]則重點關注MPO和來源于NETs的DNA共定位研究。盡管蛋白質印跡法和ELISA是目前實驗室最常用的檢測方法，但是大多數ELISA方法對樣品依賴性強(例如：孵育時間，移液失誤)，通常不是自動化，與本法相比，需要更長的測定時間。流式細胞術略去洗滌步驟，大大提高了酶蛋白靈敏度[26]。然而，流式細胞術應用于蛋白有一定的局限性，如：一般檢測的是細胞質內的MPO，給NETs定量造成一定誤差。

2.2.3熒光免疫層析法 該法原理與ELISA相似，兩種試驗方法都是依賴于標記的抗體特異性檢測抗原，可實現待測樣品的定性和定量。王云龍等利用EDC(可溶于水的碳二亞胺)活化的羧基熒光微球與MPO抗體偶聯形成標記復合物，保護基質在不受熒光物質影響下定量檢測MPO，為冠心病的臨床快檢提供了新思路。Funchal等[27]檢測到NETs能由真菌、細菌和病毒誘導產生，特別是呼吸道合胞體病毒的F蛋白，而其結構中的蛋白質(NE、MPO)來自嗜天青顆粒。熒光免疫層析法的優點是熒光標記物的信號強度和激光強度呈正相關，降低層析技術的檢測限，滿足快檢的要求。但該法對化學成分的抗干擾能力差，限制了其在蛋白定量中的應用。

3 其他組分的檢測NETs法

血清中炎癥因子IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、H3Cit(瓜氨酸化的H3組蛋白)[28]可加速NETs網狀結構的生成。比較患者組和對照組炎性因子的差異，分析IL、TNF 和 NETs 成分 NE、MPO 相關性，是另一個決定初期中性粒細胞網狀結構的標志，然而，除了NETs，粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞也會刺激機體產生大量炎性因子，所以利用該法對NETs定量的準確率不高，建議只作為一種參照。

4 展望

已知NETs在糖尿病、系統性紅斑狼瘡和小血管炎、類風濕關節炎等炎性疾病中發揮局部免疫作用[29]。但是，目前定量體內NETs的研究尚處于初級階段。近年來，檢測NETs大多以簡單熒光標記染色法為主，測定范圍廣、操作簡單、但是標記物篩選存在相當大誤差。隨著顯微鏡技術和數字分析技術的發展，綜合使用精密儀器可提高定量目標NETs的成功率，然而，大型儀器成本高，且不能實現體內cfDNA、NE、MPO濃度的自動化測定[30]。為了克服這些檢測手段的局限性，有必要發展新的低成本高準確性的自動化檢測手段，簡單快速確定NETs的濃度，為臨床患者提供新的診療依據，以期改善慢性炎癥及癌癥的治療現狀。