隱丹參酮對肺癌細胞鐵死亡相關(guān)基因表達的影響

譚國耀，蔡珮蘅，曹 霖，王黛菲，金 晶

(中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率增長最快的癌癥之一，嚴重威脅人類的健康和生命。即使許多發(fā)達國家擁有先進的檢測和治療方法，患者5年生存率仍不足20%[1]。目前，肺癌的治療方式主要包括化療、手術(shù)、放療和分子靶向治療[2]，其中化療仍然是肺癌各個階段的重要的治療方式[3]。隨著疾病的發(fā)生發(fā)展，患者往往會對順鉑等傳統(tǒng)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，從而使藥效降低。因此，尋找有效的肺癌治療藥物顯得尤為重要。

鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡模式，主要特征是鐵離子依賴性的脂質(zhì)過氧化物的堆積[4]。不同于細胞凋亡、細胞壞死和自噬，發(fā)生鐵死亡的細胞在形態(tài)、生化和免疫特征上與其他3種細胞死亡方式有較大差別[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]，鐵代謝和活性氧簇(reactive oxygen species， ROS)代謝與細胞鐵死亡密切相關(guān)，而鐵代謝和ROS代謝通路上的相關(guān)基因則被認為是鐵死亡的重要調(diào)節(jié)因子。目前的研究發(fā)現(xiàn)，鐵代謝的失調(diào)可能與多種生理病理過程有關(guān)，包括癌細胞的死亡、神經(jīng)退行性疾病以及急性腎功能衰竭等。

隱丹參酮(cryptotanshinone，CTS)是傳統(tǒng)中藥丹參中的一種脂溶性有效成分，最初多應(yīng)用于心血管疾病的研究。而近年來，CTS在抗腫瘤方面的研究逐漸增多。許多研究表明，CTS對多種腫瘤細胞的生長具有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，CTS可以明顯降低A549細胞的NADPH水平，升高ROS水平，對細胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生影響，影響ROS代謝通路。因此，CTS對腫瘤細胞的增殖抑制作用可能與鐵死亡有關(guān)。

本研究以人肺癌A549細胞及其順鉑耐藥株A549/DDP細胞為研究對象，初步探討CTS對A549細胞和A549/DDP細胞中鐵死亡相關(guān)基因表達的影響，為進一步開展CTS的抗腫瘤機制研究提供新思路，并為CTS用于肺癌治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株與試劑 人肺癌A549細胞和順鉑耐藥A549/DDP細胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所饋贈；CTS購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清購自美國Gibco公司；青霉素鏈霉素溶液、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄、SYBR green試劑購自日本TaKaRa公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，ECL化學(xué)發(fā)光液購自北京Engreen公司；兔抗TFR1抗體購自美國Proteintech公司；兔抗GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology (CST)。

1.1.2儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；PCR儀(德國Eppendorf公司)；實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)；電泳、電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Image Quant LAS4000曝光成像儀(美國General Electric公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) A549細胞和A549/DDP細胞接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時，可用于實驗。

1.2.2CCK-8檢測細胞存活率 將處于對數(shù)生長期的A549細胞和A549/DDP細胞分別接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。加入100 μL含不同濃度CTS的培養(yǎng)液，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋CTS，使其終濃度分別為5、10、15、20 μmol·L-1，空白對照組為含相同濃度DMSO的DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，將孔中液體吸出，另設(shè)4個空白復(fù)孔，每孔加入100 μL含10% CCK-8的無血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h后，置于搖床上低速震蕩30 s，使孔內(nèi)顏色分布均勻。檢測波長為450 nm的吸光度值(optical density，OD)，細胞存活率/%=(實驗組OD-空白孔OD)/(對照組OD-空白孔OD)×100%。

1.2.3qPCR檢測mRNA表達 A549細胞和A549/DDP細胞經(jīng)CTS處理48 h后，終止細胞培養(yǎng)。分別提取兩種細胞的總RNA，按照說明書的步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，qPCR檢測與鐵代謝相關(guān)的TFR1、DMT1、IREB2、HSPB1、VDAC2、VDAC3、GPX4的mRNA表達水平，以ACTB作為內(nèi)參。引物序列見Tab 1。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 A549細胞和A549/DDP細胞經(jīng)CTS處理48 h后，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入100 μL裂解液，置于冰上裂解30 min，刮取裂解液收集于1.5 mL EP管超聲15 s，于4 ℃ 16 000×g離心20 min，獲得細胞總蛋白。進行蛋白定量后，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴變性10 min。按每孔25 μg總蛋白計算上樣量，電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗TFR1、GAPDH ，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次7 min，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，顯影。使用Image J軟件分析結(jié)果。

利用MC模擬和近似取值這兩種電子能譜取值方法，模擬相同條件下的SGEMP電磁場波形，對比分析電子能譜近似取值方法帶來的偏差。SGEMP模擬選用3維全電磁粒子模擬PIC 程序UNIPIC[7-9]，該軟件采用粒子共形的電子發(fā)射技術(shù)及電磁場共形推進算法[10-11]。

Tab 1 Sequences of primers for selected genes

2 結(jié)果

2.1 CTS對A549細胞和A549/DDP細胞存活率的影響采用CCK-8法考察CTS對A549細胞和A549/DDP細胞存活率的影響。如Fig 1所示隨著CTS濃度的增高，細胞的存活率降低，提示CTS能夠抑制A549細胞和A549/DDP細胞的增殖，對A549細胞的IC50為8.654 μmol·L-1，對A549/DDP細胞的IC50為4.785 μmol·L-1，表明順鉑耐藥細胞A549/DDP對CTS的作用更敏感。

2.2 CTS對鐵代謝通路相關(guān)基因mRNA表達的影響為探討CTS對肺癌細胞存活率的影響是否與鐵死亡相關(guān)基因有關(guān)，采用qPCR技術(shù)初步考察了其對細胞鐵死亡相關(guān)基因mRNA水平的影響。如Fig 2所示，CTS處理后，A549細胞HSPB1和GPX4的mRNA表達水平增高，IREB2、VDAC2和VDAC3的mRNA表達水平降低，TFR1和DMT1的mRNA表達水平變化不明顯；A549/DDP細胞TFR1和IREB2的mRNA表達水平增高，VDAC3的mRNA表達水平降低，DMT1、HSPB1、VDAC2和GPX4的mRNA表達水平變化不明顯。

2.3 CTS對TFR1蛋白表達水平的影響TFR1是存在于細胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，對細胞的鐵穩(wěn)態(tài)起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此考察CTS對TFR1蛋白表達水平的影響。如Fig 3所示，與對照相比，CTS處理后A549/DDP細胞TFR1表達水平增高，當(dāng)CTS濃度為2.5 μmol·L-1時，TFR1表達水平增高最明顯，而CTS對A549細胞TFR1蛋白表達水平則影響不明顯。

Fig 1 Effect of CTS on viability of A549 cells and A549/DDP cells n=4)

Fig 2 Effect of CTS on relative mRNA levels in A549 cells (A) and A549/DDP cells (B) n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control

3 討論

鐵死亡是一種鐵離子依賴性的細胞調(diào)控死亡模式，最初是在對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中被提出。隨著研究的深入，鐵死亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也逐漸凸顯出來。許多研究表明，多種藥物在腫瘤細胞中均可誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生，影響鐵死亡相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑能誘導(dǎo)A549細胞和HCT116細胞發(fā)生鐵死亡，并引起GPX4表達的變化[7]。同樣，索拉菲尼靶向system Xc-引起肝癌等多種癌細胞發(fā)生鐵死亡[8-9]。另外，柳氮磺胺吡啶能誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生鐵死亡，其機制可能和DMT1 mRNA表達水平的升高有關(guān)[10]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡可能成為腫瘤治療的一個新思路。

Fig 3 Effect of CTS on TFR1 expression in A549 cells (A) and A549/DDP cells (B) n=3)

*P<0.05vscontrol

CTS作為傳統(tǒng)中藥丹參中的有效成分，具有較好的藥理活性，在抗菌消炎和抗心血管疾病中均有較好的藥理作用。在腫瘤治療方面，CTS可以影響腫瘤細胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而抑制腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的凋亡；另外，CTS可以抑制腫瘤血管的生成并抑制腫瘤的遷移[11]。本課題組前期研究報道，CTS可以下調(diào)順鉑耐藥A549/DDP細胞Nrf2表達，影響Nrf2下游靶基因從而使細胞對順鉑敏感性升高[12]。CTS可以影響腫瘤細胞的ROS水平，引起細胞內(nèi)的氧化還原平衡的改變。我們推測，CTS對腫瘤細胞的增殖抑制作用可能與鐵死亡相關(guān)通路有所關(guān)聯(lián)，然而目前這方面的研究仍然較少。本研究初步探討CTS對鐵死亡相關(guān)通路的基因表達水平的影響，為更深入的研究提供理論基礎(chǔ)。

TFR1是細胞膜上的糖蛋白受體，是調(diào)節(jié)細胞鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Fe3+通過TFR1進入細胞，被STEAP3亞鐵還原酶還原為Fe2+，再通過DMT1介導(dǎo)釋放到細胞質(zhì)的iron pool[5]，F(xiàn)e2+的蓄積導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[13-14]。對鐵死亡敏感的細胞TFR1表達水平較高，敲除TFR1后可抑制鐵死亡陽性藥erastin引發(fā)的鐵死亡[15]。經(jīng)CTS處理后，A549細胞TFR1 mRNA和蛋白水平變化不明顯，而A549/DDP細胞TFR1 mRNA和蛋白水平均上調(diào)。細胞存活率實驗發(fā)現(xiàn)，A549/DDP對CTS的處理更敏感，提示可能與CTS處理后TFR1表達水平的變化有關(guān)，具體機制有待進一步探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CTS能夠不同程度抑制肺癌細胞A549與順鉑耐藥A549/DDP細胞的增殖，且CTS對兩種細胞鐵死亡相關(guān)基因表達呈現(xiàn)不同程度影響。本研究為開展CTS的抗腫瘤相關(guān)機制研究提供新思路，并為CTS用于肺癌治療提供理論和實驗依據(jù)。

(致謝：本實驗在中山大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理研究所完成，在此衷心感謝對本實驗給予指導(dǎo)和幫助的各位老師和同學(xué)。)