青蒿素對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及β-catenin蛋白表達的影響

楊加順，馮寶民，韓鑫龍，3， 蔡 珂，李雨桐，3，唐 玲

(1. 南方醫科大學第三附屬醫院康復醫學科，廣東 廣州 510630；2. 大連大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；3. 南方醫科大學中醫藥學院，廣東 廣州 510515；4. 廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東省中藥制劑技術工程實驗室，廣東 廣州 510515)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中國死亡率最高的癌癥之一，通常在晚期無法獲得治愈性療法，且對常規的化學治療具有高度的耐藥性[1]。因此，迫切需要更有效的HCC臨床治療方法，特別是對手術無法切除的患者。青蒿素近年來被報道具有強效的抗癌活性[2]，體內和體外研究顯示，它是抗腫瘤和免疫調節的有效候選藥物[3]。然而，青蒿素發揮特定抗癌活性的機制仍不清楚，這可能限制其在臨床的進一步發展。本研究旨在探索青蒿素對肝癌細胞的抑制作用及其抗肝癌的作用機制，以便為肝癌患者的治療和診斷提供新方法，為青蒿素在臨床肝癌治療中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人肝癌HepG2細胞株，購于ATCC細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 青蒿素，購于美國Sigma公司，在二甲基亞砜(DMSO)中制備青蒿素的儲備溶液，在培養基中處理期間DMSO的最終濃度，保持低于0.01%。DMEM培養基，購于美國Gibco公司；β-actin、β-catenin等抗體，購于美國CST公司；Western blot二抗，購于美國密理博公司；SDS-PAGE預制梯度膠，購于美國Life公司；Hoechst 33342、細胞核蛋白與細胞質蛋白提取試劑盒，購于碧云天公司；CellTiter-Blue?Luminescent Cell Viability Assay，購于美國Promega公司；流式抗體試劑盒，購于美國Pharmingen公司。

1.1.3儀器 AMOAF1000自動細胞計數儀(美國Invitrogen公司)；CYTATION5細胞成像檢測(美國Bio-Rad公司)；FUSION-FX5-820多功能成像系統(法國VILBER 公司)流式細胞儀(BD Bioscience)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與實驗分組 將HepG2細胞維持在含有10%(V/V)胎牛血清和1%(V/V)青霉素、1%(V/V)鏈霉素的培養基中進行培養。將細胞在37 ℃，含有5% CO2的濕潤環境中培養。細胞系均不超過30代的傳代數。在細胞系生長至對數期時，進行實驗處理。

1.2.2細胞增殖實驗 將3×103個HepG2細胞接種到96孔板培養24 h，加入青蒿素(0、50、100、150、200 μmol·L-1)繼續培養24、48、72 h。每孔加入20 μL CellTiter-Blue?Luminescent Cell Viability Assay，培養箱孵育10 min，然后使用細胞成像檢測儀測量Luminescent的吸光度。實驗重復3次。

1.2.3克隆形成實驗 將HepG2細胞接種在12孔板中，每孔2 000個細胞，24 h后加藥處理。培養箱中培養7 d以允許細胞生長。用1×PBS洗滌細胞2次，再用4%多聚甲醛固定30 min后，1%結晶紫溶液(V/V)染色30 min。多功能成像系統 (FUSION-FX5-820)捕獲圖像。為了量化集落形成的速率，將集落形式的染色細胞溶解在10%乙酸中，在540 nm處定量測定吸光度。實驗重復3次。

1.2.4Western blot檢測細胞質與細胞核蛋白表達 青蒿素(0、100、200 μmol·L-1)作用HepG2細胞24 h，PBS洗1遍后，用細胞刮鏟刮下細胞。離心收集細胞沉淀，采用細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒，分別提取細胞質蛋白與細胞核蛋白。使用BCA測定法測定蛋白質濃度。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離總蛋白后，濕法轉膜。用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，TBST清洗3次，加入一抗封閉過夜(4 ℃)。TBST清洗4次，二抗室溫孵育1 h后，TBST清洗4次。放入蛋白成像系統中進行曝光。實驗重復3次。

1.2.5免疫熒光實驗 100 μmol·L-1青蒿素處理HepG2細胞24 h后，提取于6孔板中的細胞進行爬片,加入1 mL 4%多聚甲醛固定液, 室溫固定15 min。棄去固定液, 用PBS洗3遍, 每次5 min, 封閉緩沖液中封閉60 min。加入稀釋好的一抗β-catenin，4 ℃過夜，PBS洗3遍, 每次5 min，加入二抗Hoechst避光孵育1～2 h，PBS洗3遍, 每次5 min，5%甘油封片，在共聚焦顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞凋亡率 青蒿素100 μmol·L-1處理24 h后，收集HepG2細胞，并在4 ℃、1 000×g離心5 min。用冰冷的PBS沖洗沉淀，并用70%乙醇固定2 h。然后將細胞用染色緩沖液(含有20 mg·L-1碘化丙啶，20 mg·L-1AnnexinⅤ)在37 ℃避光染色15 min。通過流式細胞儀分析細胞凋亡率。實驗重復3次。

2 結果

2.1 青蒿素對HepG2細胞增殖的抑制作用Fig 1結果顯示，隨著藥物濃度的增大，HepG2細胞的生長受到抑制，且在青蒿素100 μmol·L-1時，隨著時間的延長，HepG2細胞生長也受到抑制。這表明青蒿素對肝癌HepG2細胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性、時間依賴性。

Fig 1 Effects of artemisinin on viability

A.Artemisinin inhibits the growth of liver cancer cells at different concentrations and different time；B.Artemisinin( 100 μmol·L-1) inhibits the growth of liver cancer cells at different time.**P<0.01vscontrol

2.2 青蒿素對HepG2細胞集落形成的影響Fig 2的集落形成實驗結果顯示，當青蒿素濃度依次增大時，與空白對照相比較，細胞克隆依次減少。青蒿素50 μmol·L-1時，細胞克隆數降低到(52.46±1.38)%左右；當青蒿素濃度增大到100 μmol·L-1時，細胞克隆數降到(29.06±1.84)%左右。

Fig 2 Colony forming ability of liver cancer cells inhibited

**P<0.01vscontrol

2.3 青蒿素對HepG2細胞凋亡率的影響Annexin V-FITC/PI雙染結果顯示(Fig 3)，不同濃度的青蒿素作用24，與空白對照相比，實驗組的細胞凋亡率增加，并呈濃度依賴性。經100 μmol·L-1青蒿素處理24 h后，實驗組HepG2細胞的凋亡率增加為(5.87±0.37)%，經150 μmol·L-1和200 μmol·L-1青蒿素處理后，其凋亡率增加到(10.57±0.15)%和(18.28±1.31)%，其凋亡率明顯升高。

2.4 青蒿素對HepG2細胞內相關蛋白表達變化的影響Fig 4的Western blot 結果表明，在青蒿素加藥24 h后，與空白對照相比較，隨著青蒿素濃度升高，PARP的表達呈上調趨勢，說明青蒿素能誘導人肝癌HepG2細胞凋亡。如Fig 5所示，青蒿素作用下，HepG2細胞質中的β-catenin蛋白表達上調，且在免疫熒光實驗中也看到這一現象。提示青蒿能夠使HepG2細胞質中β-catenin蛋白表達上調。

3 討論

HCC是全球癌癥相關死亡的主要原因之一，超過80%的肝癌病例發生在中國和非洲等發展中國家[4]。HCC具有長潛伏期，但發展迅速通常到晚期時才被診斷出來。這些特征加上其高度入侵的可能性，導致患有該疾病的患者不能得到有效的治療。因患有大腫瘤(直徑>5 cm)或多個病灶(>3)的患者通常不適合肝切除術[5]。

Fig 3 Effect of artemisinin on apoptotic rate

**P<0.01vscontrol

青蒿素是一種從植物青蒿(ArtemisiaannuaLinn.)中分離出來的天然產物，被廣泛用作抗瘧疾藥物[6]。近年來，青蒿素及其衍生物也已經顯示出具有抗癌作用，其抗癌活性的主要機制是誘導細胞凋亡[7]。青蒿素及其衍生物的抗癌潛力與c-Myc、CDC25A、EGFR、γ-谷氨酰胺合成酶(GLCLR)等不同分子的表達有關[8-9]。青蒿素還調節u-PA、MMP-2、MMP-7和MMP-9的水平，所有這些都與轉移相關[10-11]。但青蒿素在肝癌細胞中的應用和作用機制研究尚少，雖然詳細的機制仍有待闡明，但其低宿主毒性是開發青蒿素作為抗癌劑的主要動力。

本實驗通過觀察青蒿素對人肝癌細胞HepG2的細胞毒作用，表明不同濃度的青蒿素對HepG2細胞有不同的抑制作用。隨著青蒿素濃度的增大，其對HepG2的抑制作用也隨之增強；同一藥物濃度，隨著青蒿素作用時間的延長，其對HepG2細胞的抑制作用也隨之增強。在細胞活性實驗結果中，當青蒿素濃度為100 μmol·L-1時，藥物作用24 h時能夠抑制(25.61±3.51)%的HepG2細胞生長；藥物作用48 h時能夠抑制(35.80±8.42)%的HepG2細胞生長；藥物作用72 h時能夠抑制(48.36±4.64)%的HepG2細胞生長。

Fig 4 Effect of artemisinin on expression of PARP protein

**P<0.01vscontrol

細胞克隆實驗中，隨著藥物濃度的增大，其克隆數也逐漸減少，在青蒿素濃度為100 μmol·L-1時，其抑制(70.93±2.26)%左右的HepG2細胞。本實驗也證實了青蒿素能夠誘導肝癌細胞HepG2凋亡，流式細胞實驗中，與對照組相比較，其實驗組凋亡率明顯增加，且隨著藥物作用時間的延長而增加。且Western blot實驗證實了與空白對照相比，PARP蛋白的表達上調，并產生了明顯的剪切體。其結果能客觀反映人肝癌細胞體外的藥物敏感性，也為后續實驗中藥物不同劑量梯度的設定奠定實驗依據，可作為體外篩選藥物濃度的方法。

據報道，β-catenin蛋白通過Wnt信號轉導途徑起致癌作用[12]。Wnt/β-catenin信號轉導在維持上皮細胞表型、細胞與細胞的連接和組織穩態中起重要作用[13]。該途徑成員的失調可促使上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的發生。β-catenin是Wnt/β-catenin信號傳導途徑的關鍵效應分子[14]。在正常上皮細胞和非腫瘤環境中，β-catenin位于細胞膜上。一旦EMT發生，β-catenin會從細胞質中轉移到細胞核(充當轉錄激活因子)，促使EMT相關基因表達，進而促使腫瘤細胞的侵襲和轉移。因此，β-catenin從細胞質向細胞核的轉運，在促進EMT相關基因的表達中起重要作用。本實驗中，Western blot和免疫熒光實驗結果顯示，與空白對照相比較，青蒿素能夠上調HepG2細胞質中β-catenin蛋白的表達，而細胞核內的β-catenin無明顯變化。因此，我們假設青蒿素能夠抑制β-catenin從細胞質向細胞核的轉運，抑制EMT的發生，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。

Fig 5 Effect of artemisinin on expression of β-catenin protein in HepG2

A.Immunoblot against β-catenin shows the increased cytoplasmic β-catenin protein expression upon artemisinin treatment. GAPDH and Lamin B1 used as loading control; B. Immunofluorescence assay shows the expression of β-catenin upon artemisinin treatment.**P<0.01vscontrol

綜上所述，青蒿素能夠誘導人肝癌細胞HepG2的凋亡，也可通過抑制β-catenin從細胞質向細胞核的轉運，進而抑制上皮細胞向間充質細胞的轉變，從而抑制了肝癌細胞的侵襲和轉移。該研究將為青蒿素在臨床治療中提供科學的實驗依據。然而, 青蒿素是否可以作為一種有效的輔助手段用于肝癌患者的治療，還有待更加深入的研究。