黃芪多糖對黃嘌呤氧化酶誘導的肺癌A549細胞自噬及PI3K/AKT信號通路的影響

王雪林，李 楊，劉丹，王彥君，明海霞,4

(1.甘肅中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生理教研室，2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學與中醫(yī)藥防治研究重點實驗室,3.甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究所，4.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000)

近年來研究提示，細胞存活能力基于消除壓力條件的能力，此種過程涉及自噬和細胞凋亡的調(diào)節(jié)及相互整合[1]。腫瘤細胞可通過自噬作用抵抗由于過度增殖造成的營養(yǎng)缺乏和缺氧，以維持生存[2]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)是黃芪(astragalus membranaceus，AM)干燥根主要的活性成分之一，在肺癌的治療中應用廣泛[3]。自噬與肺癌發(fā)生和治療的關系是近年來的研究熱點，因此，本實驗采用20 U·L-1黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)作用于人肺癌A549細胞24 h誘導自噬發(fā)生[4]，前期預實驗利用透射電鏡與Western blot驗證自噬模型，結果提示XOD可成功誘導人肺癌A549細胞發(fā)生自噬；模型成功后通過藥物干預，觀察并檢測APS對人肺癌A549細胞自噬模型增殖、自噬小體形態(tài)及自噬相關分子表達的影響。

1 材料

1.1 細胞株人肺癌A549細胞株購買于中國科學院上海細胞庫，保存于甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心超低溫冰箱。

1.2 試劑黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)，購自Sigma公司；APS(純度>90%)，購自中國上海源葉生物科技公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(純度>99%)，購自APExBIO公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，購自中國杭州四季青公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶、青霉素鏈霉素混合液，購自gibco公司；Gluta固定液(電鏡專用，2.5%)，購自Solarbio公司；細胞計數(shù)(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒，購自中國上海翊圣公司；蛋白提取試劑盒和SDS-PAGE 凝膠快速制備試劑盒，均購自Solarbio公司；微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha，LC3A/B)抗體、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)、抗體死骨片1(Seques-tosome 1，SQSTM1/p62)抗體、3-磷酸肌醇激酶(phosphoinosi-tide 3-kinase，PI3K)多克隆抗體，均購自Gene Tex公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體，購自Immunoway公司；山羊抗兔IgG二抗，購自Abcam公司。

1.3 儀器超凈工作臺(蘇潔凈化公司，SW-CJ-1D)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋電機公司，MCO-18AIC)；酶標儀(美國BIO-RAD公司，IMARK)；全自動細胞熒光計數(shù)分析儀(美國CELLOM ETER公司，AUTO X4)；倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS 公司，IX81)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司，Chemi Doc)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo公司，900 SERIES)；透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM，日本電子株式會社，JEM-2100F)。

2 方法

2.1 A549細胞培養(yǎng)取肺癌A549細胞株1支，移至37 ℃恒溫水浴鍋中迅速解凍復蘇，移液槍移至5 mL培養(yǎng)體系的培養(yǎng)瓶中，將提前配好的完全培養(yǎng)基加至5 mL，并加入50 μL青霉素鏈霉素混合液，置于5% CO2、37 ℃飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，于次日PBS輕柔洗滌并換液1次，待細胞完全貼壁后可2～3 d換液1次，融合度達80%后，0.25%胰蛋白酶1 mL進行消化傳代，取第3代細胞用于實驗。

2.2 肺癌A549細胞自噬模型的建立及分組實驗采用5 mL培養(yǎng)體系培養(yǎng)瓶進行細胞培養(yǎng)，分為空白組、模型組、(100、200、400) mg·L-1APS 處理組、2 mmol·L-13-MA處理組，每組設3個平行樣本。給藥干預前，除空白組外，其余5組使用20 U·L-1XOD干預24h，建立自噬模型，前期預實驗觀察自噬體形態(tài)和檢測自噬標志蛋白LC3B、p62水平，結果提示XOD可成功誘導肺癌A549細胞發(fā)生自噬。按照實驗分組，造模成功后，模型組給予完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，其余4組分別加入相應濃度的藥物處理24h。采用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)，收集細胞進行指標的檢測。

2.3 CCK-8檢測各組細胞生長曲線收集對數(shù)期各組細胞，移液槍吹打均勻制成細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞濃度至2×107·L-1，將其接種于96孔板，每孔接種100 μL細胞懸液，設6個復孔，在接種有細胞孔的外圍加入100 μL PBS以排除干擾；待測前1～2 h加入10 μL CCK-8溶液，于酶標儀分別檢測接種后第6、12、24、48、72 h 450 nm波長處的OD值，每組檢測3次。

2.4 透射電鏡觀察自噬小體的形態(tài)各處理組A549細胞培養(yǎng)48小時后，PBS沖洗3次，胰蛋白酶消化細胞1 min左右，倒置顯微鏡下觀察細胞變圓、變亮及間隙增大，立即加入500 μL完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打直至細胞全部脫落，將細胞懸液移至1.5 mL子彈頭離心管封口離心，細胞離心至管底，吸出廢液，加入1 mL PBS連續(xù)離心2次，管底細胞團至米粒樣大小，棄掉上清，加入200 μL體積分數(shù)為0.025的戊二醛，4 ℃冰箱過夜固定細胞，PBS洗滌3次，用4 ℃預冷的體積分數(shù)為0.01鋨酸固定2 h，PBS洗滌3次，體積分數(shù)為0.5、0.7、0.8、0.9、1乙醇及體積分數(shù)為1的丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，超薄切片機切片，厚約50～70 nm，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，制片成功后，透射電鏡觀察并拍照。

2.5 Western blot檢測肺癌A549細胞LC3B、p62、PI3K、AKT等蛋白的表達收集各組細胞，提取細胞蛋白并定量。各組樣品恢復至室溫后上樣，經(jīng)0.05、0.12 SDS-PAGE分離，轉膜，封閉后，分別與一抗LC3A/B(1 ∶150)、p62(1 ∶1 000)、PI3K(1 ∶1 000)、AKT(1 ∶1 000)及 GAPDH(1 ∶5 000)蛋白相結合，室溫搖床過夜；次日PBST侵洗后分別與山羊抗IgG二抗(1 ∶5 000)結合，室溫輕搖1 h；HRP-ECL發(fā)光顯色后，凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測。采用Quantity One 4.6.2軟件對圖像進行灰度值分析，以GAPDH作內(nèi)參，蛋白相對表達量為目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的比值，每組測3組數(shù)據(jù)。

3 結果

3.1 黃芪多糖對肺癌A549細胞增殖活力的影響如Fig 1所示，與空白組比較，模型組、APS (200、400) mg·L-1干預組及3-MA組在第12～48 h，細胞活力顯著性降低，100 mg·L-1APS干預組在第12～48 h，細胞活力增強(P<0.05)；與模型組比較，APS (200、400) mg·L-1干預組與3-MA組在第12～48h，細胞活力降低(P<0.05)；與3-MA比較，APS (200、400) mg·L-1干預組對肺癌A549細胞活力抑制能力更接近；且APS各干預組在第24 h出現(xiàn)作用峰值。

Fig 1 Effect of APS on proliferation of A549 cells in a XOD-induced autophagy model

3.2 XOD誘導自噬小體形態(tài)及APS對其影響如Fig 2、3所示。TEM結果提示，空白組肺癌A549細胞內(nèi)可觀察到線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本形態(tài)及脂肪滴。與空白組比較，經(jīng)XOD處理后的模型組，細胞內(nèi)可見雙層膜自噬小體、脂滴及自噬泡，LC3B蛋白表達顯著性增高，p62蛋白表達降低(P<0.05)。與模型組比較，100 mg·L-1APS干預組細胞內(nèi)仍可見雙層膜自噬小體及其吞噬的內(nèi)容物，LC3B蛋白表達顯著性降低，p62蛋白表達增高(P<0.05)；與模型組比較，APS (200、400)mg·L-1干預組細胞內(nèi)幾乎觀察不到自噬小體，3-MA組細胞內(nèi)偶見自噬小體，LC3B蛋白表達顯著性降低，p62蛋白表達增高(P<0.05)。

3.3 APS對肺癌A549細胞自噬模型LC3B、p62、PI3K、AKT蛋白表達的影響如Fig 3所示。與空白組比較，模型組LC3B及PI3K蛋白表達增高，p62及AKT降低(P<0.05)。與模型組比較，200、400 mg·L-1APS組及3-MA組LC3B、PI3K蛋白表達下降，p62及AKT蛋白增高(P<0.05)。與3-MA組比較，200 mg·L-1APS組LC3B蛋白表達下降，400 mg·L-1APS組PI3K蛋白下降(P<0.05)。

Fig 2 Ultrastructure of autophagosomes in A549 cells of each group(×25 000, bar=0.5 μm)

A:Control group;B:Model group;C:100 mg·L-1of APS-treated group;D:200 mg·L-1of APS-treated group;E:400 mg·L-1of APS-treated group;F:2 mmol·L-1of 3-MA treated group.

4 討論

真核生物在進化過程中，保留自噬用于細胞內(nèi)物質(zhì)的更新，特別是PI3K/AKT信號通路與大多數(shù)生理過程相關，包括細胞代謝、增殖等。在腫瘤中，自噬對細胞具有保護和細胞毒性雙重作用，一方面通過自噬作用維持基因組完整性和防止腫瘤細胞增殖，與免疫監(jiān)視作用相結合防止腫瘤發(fā)生；另一方面在已發(fā)生的實體瘤中，腫瘤細胞外環(huán)境缺氧和營養(yǎng)缺乏影響其自身生存，迫于生存壓力，腫瘤細胞可利用自噬機制，獲得繼續(xù)生長的能量及增殖的空間[5]。因此，利用某種藥物抑制此過程中的自噬作用，可起到抗腫瘤目的。

自噬是一種細胞內(nèi)溶酶體參與分解未折疊蛋白或處理變異蛋白、降解胞內(nèi)受損的細胞器、外源微生物的自我保護機制，形態(tài)學上以形成自噬體為特征。LC3定位于自噬泡的內(nèi)層膜，其表達產(chǎn)物LC3A 隨著自噬過程被啟動，與磷脂酰乙醇胺結合形成膜型LC3B，其含量與自噬發(fā)生程度正相關，間接反映自噬體數(shù)量，被認為是判定自噬活性的特異性靈敏標志分子[6]。相反當自噬抑制后，p62蛋白開始累積，而當自噬誘導時，p62水平下降，但LC3B的增加與p62的下降并無明顯相關[7]。因此，可采用自噬標志性蛋白LC3B與p62及透射電鏡觀察自噬小體典型形態(tài)學特征(即大量雙層膜結構)共同監(jiān)測自噬反應[8-9]。

Fig 3 Expression of autophagy markers LC3A/B, p62, AKT and PI3Kin each

A:Control group;B:Model group;C:100 mg·L-1of APS-treated group;D:200 mg·L-1of APS-treated group;E:400 mg·L-1of APS-treated group;F:2 mmol·L-1of 3-MAtreated group.*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsmodel group;#P<0.05vs3-MA-treated group.

李蓉[10]、廖雙葉[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可抑制人肺癌A549細胞增殖及促進細胞凋亡。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)[12]，APS及聯(lián)合化療藥物順鉑(cis-diamm inodichloroplatinum Ⅱdichloride，DDP)可能通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑相關蛋白抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生長。細胞凋亡(Ⅰ型細胞程序性死亡)和細胞自噬(Ⅱ型程序性死亡)是細胞程序性死亡的兩種主要表現(xiàn)。因此，本研究在前人實驗基礎上，尋求APS對肺癌A549細胞自噬的影響及其分子機制。實驗結果發(fā)現(xiàn)，200、400 mg·L-1APS組及自噬抑制劑3-MA組細胞內(nèi)自噬反應明顯減弱，同時細胞活性降低，與蒲澤錦等[13]研究結果一致。TEM結果提示：與空白組比較，經(jīng)XOD處理24 h后的模型組，細胞可見雙層膜自噬小體、脂滴及自噬泡，LC3B蛋白表達增高，p62及AKT顯著性降低，PI3K蛋白升高，TEM與Western blot結果共同確定模型組發(fā)生較高水平的自噬(P<0.05)；與模型組比較，200、400 mg·L-1APS干預組細胞內(nèi)幾乎觀察不到自噬小體，LC3B蛋白表達降低，p62及AKT蛋白增高，PI3K蛋白下降，且細胞活性降低(P<0.05)，TEM與Western blot共同提示200、400 mg·L-1APS可降低A549細胞自噬水平；與3-MA組比較，200 mg·L-1APS組LC3B蛋白表達下降，400 mg·L-1APS濃度組PI3K蛋白下降(P<0.05)，這表明APS對PI3K蛋白表達的抑制優(yōu)于3-MA。上述結果表明APS可抑制肺癌A549細胞的自噬程度，可能與調(diào)節(jié)LC3B、PI3K及AKT蛋白表達有關，使用PI3K抑制劑3-MA可以阻斷LC3的表達，APS具有相同趨勢[14]。通過降低PI3K蛋白表達阻斷自噬泡和溶酶體的融合，降低LC3B蛋白表達而抑制自噬小體雙層膜的形成，從而抑制自噬程度[15]。APS可增高AKT蛋白的表達，可能與PI3K蛋白表達降低致使其對下游分子AKT蛋白的活化作用減弱有關，使得AKT積累。綜上所述。APS可能通過抑制PI3K/AKT信號通路發(fā)揮自噬抑制作用。因此，我們推測APS能通過自噬抑制作用，使A549細胞面臨快速增殖帶來的缺氧和營養(yǎng)缺乏等困境，進而抑制腫瘤細胞的生長。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，APS可能通過抑制肺癌A549細胞自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用。