小檗堿對高糖誘導足細胞凋亡的干預作用及其相關調控機制研究

李 超，關錫梅，倪偉建，唐麗琴

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)藥劑科，安徽 合肥 230001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發癥，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。DN的發病機制十分復雜，主要為糖脂代謝紊亂、炎癥介質釋放、氧化應激、細胞凋亡等多種因素的共同作用，引起腎小球濾過屏障的破壞、腎小管炎性細胞浸潤、腎小球硬化、小管間質纖維化等，最終促進疾病的發展與轉化[2-3]。眾多病理改變中，腎小球濾過屏障的損傷可顯著性的影響腎小球的濾過功能，進而引起蛋白尿與腎臟功能損傷，促進糖尿病腎病的進一步發展。研究發現，腎小球足細胞是一種高度分化的上皮細胞，在腎小球濾過膜中，足細胞是維持整個腎小球濾過膜正常通透性的主要成分，足細胞結構的完整性和數量維持一定的比率，是保證腎小球濾過膜功能正常運行的基礎，足細胞的損傷和凋亡會引起蛋白尿并最終導致腎功能損害，是觸發和加速糖尿病腎病的關鍵因素之一[4]。 因此，干預腎小球足細胞凋亡有利于延緩和治療糖尿病腎病。

小檗堿(berberine，BBR)是從黃連中提取的一種異喹啉生物堿單體，對多種疾病如高脂血癥、高血壓、炎癥、腹瀉和腫瘤等均有一定的調節作用，多種證據表明，小檗堿在治療糖尿病及其并發癥如糖尿病腎病方面具有巨大的治療潛力[5-7]。

高糖環境能夠對腎小球濾過膜產生直接和間接的損傷，其中，高糖對腎小球足細胞的影響表現在足細胞數量減少、黏附能力下降、足突消失以及屏障功能減弱，導致蛋白尿發生，最終出現腎小球硬化、腎功能進行性喪失等[8-10]。本實驗通過體外高糖培養腎小球足細胞，研究不同濃度高糖在不同時間對足細胞凋亡的誘導與促進作用，為臨床干預足細胞凋亡提供參考；研究小檗堿對高糖誘導足細胞凋亡的調節作用，并探討相關凋亡通路的變化，為足細胞損傷和糖尿病腎病的藥物治療提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 小鼠腎小球足細胞，北納生物，貨號：337685；小檗堿，純度≥95.0%，由安徽省立醫院藥劑科藥學實驗室提供。

1.1.2試劑 CCK-8細胞活力試劑盒，貝博生物，貨號：BB4202；小鼠重組γ干擾素，MedChemExpress公司，批號：33158；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒，諾唯贊生物，貨號：A211-02；RPMI 1640培養基，Hyclone公司，貨號：SH30809.01；Hoechst細胞凋亡染色試劑盒，碧云天生物，貨號：C0003；GAPDH、caspase-3、caspase-6、caspase-7、caspase-8、caspase-9、Bcl-2單克隆抗體，Cell Signaling Technology，貨號：5174、9662、9762、9492、9746、9508、15071；BCA試劑盒，碧云天生物，貨號： P0010S；胎牛血清，四季青生物，貨號：11011-8611；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，Proteintech公司，貨號： SA00001-1，SA00001-2。

1.1.3儀器 CO2培養箱(Heal Force公司)；酶標儀(Molecular Devices公司)；流式細胞儀(Beckman Coulter公司)；凝膠成像系統(Peiqing公司)；熒光顯微鏡(Leica公司)，激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 用(含10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素)RPMI 1640培養基于33 ℃，5% CO2培養箱中培養細胞，并加入0.2%小鼠重組γ干擾素(IFN-γ)。當細胞生長至70%～80%時，將細胞轉移至37 ℃，5% CO2培養箱(培養基中無IFN-γ)誘導分化1～2周。隨后，將分化的足細胞用于實驗。

1.2.2高糖誘導足細胞凋亡 將足細胞消化處理計數后接種6孔板，用5.5、10、15、20、25、30 mmol·L-1濃度的高糖培養基培養，均于12、24、36、48、60、72 h后在顯微鏡下觀察各組足細胞的形態。

1.2.3CCK-8檢測足細胞活力 取對數生長期細胞，計數后加入細胞懸液于96孔板中，置37 ℃，5% CO2培養箱過夜。每組依次加入3.75、7.5、15、30、45、60、75、90 μmol·L-1高糖培養基(30 mmol·L-1葡萄糖)配制的小檗堿溶液，并設置空白對照(未加入細胞)和正常對照(5.5 mmol·L-1葡萄糖)和模型對照組(30 mmol·L-1葡萄糖)，于37 ℃孵育24 h，每孔加入CCK-8溶液10μL，于37 ℃孵育1h，用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光值，并計算細胞活力值。

1.2.4Hoechst染色觀察足細胞凋亡 取對數生長期的細胞，計數后加入細胞懸液于6孔板中。設置5組：正常組，高糖組，BBR(30、45、60 μmol·L-1)組，置37 ℃，5% CO2培養箱過夜。每組依次加入培養基和BBR溶液，37 ℃孵育24 h后，每孔加入0.5 mL的細胞固定液固定20 min，PBS洗滌2次，吸干液體后加入Hoechst染液避光孵育5 min，PBS再次洗滌后于熒光顯微鏡下觀察細胞核的顏色變化。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染檢測足細胞的凋亡 取對數生長期足細胞，用0.25% 胰酶消化后，計數后加入細胞懸液于6孔板，24 h后加入不同濃度的BBR溶液，培養24 h后，用0.25%(不含EDTA)胰酶消化細胞，與培養液共收集后，400g離心5 min，重懸，再離心。每個樣品摻入5 μL FITC和5 μL PI染色溶液并在黑暗中溫育10 min，同時建立單染色對照和單染色FITC和PI，流式儀測定每組足細胞的凋亡率。

1.2.6激光共聚焦顯微鏡檢測caspase-3蛋白的表達 將細胞在24孔板中培養。 用4%多聚甲醛處理細胞30 min并用PBS洗滌3次。然后用3%的BSA 封閉30 min，并在4 ℃下與caspase-3一抗(1 ∶500)孵育過夜。PBS洗滌2 次，與二抗(1 ∶200)在37 ℃下孵育2 h，然后DAPI染色10 min，PBS洗滌3次，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7Western blot檢測相關蛋白的表達 收集加藥24 h后的細胞，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，經BCA 法進行蛋白定量后，通過SDS-PAGE凝膠電泳對蛋白樣品進行分離，并將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，將PVDF膜置于以下一抗(1 ∶1 000)中并在4 ℃孵育過夜，然后將PVDF膜洗滌3次后在二抗(1 ∶5 000)中孵育2 h。TBST洗滌3次后，使用發光試劑進行顯色，通過Imagine J對條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 高糖對足細胞凋亡的影響Fig 1結果顯示，與正常組相比，在相同高糖誘導時間下，高糖濃度不同，足細胞的凋亡率不同。高糖(10、15、20、25、30 mmol·L-1)組在12 h未觀察到細胞凋亡；在24 h時，高糖(15、20、25 mmol·L-1)組仍未見凋亡，高糖(30 mmol·L-1)組有少量細胞凋亡；在36 h時可觀察到高糖(10、15、20 mmol·L-1)組未見凋亡細胞，高糖(25、30 mmol·L-1)組出現凋亡細胞，且高糖(30 mmol·L-1)組凋亡細胞增多；在48 h時可觀察到高糖(20 mmol·L-1)組出現凋亡細胞，高糖(25、30 mmol·L-1)組細胞凋亡數量增加。在60 h時，高糖(20、25、30 mmol·L-1)組凋亡細胞增多，在72 h時，高糖(10 mmol·L-1)并未引起凋亡，高糖(15 mmol·L-1)出現少量凋亡細胞。

Fig 1 Effect of different concentrations of high glucose on podocyte apoptosis at different time points

2.2 BBR對高糖誘導足細胞活性的影響Fig 2的CCK-8結果表明，高糖組細胞活力值較正常組明顯降低(P<0.01)；與高糖組相比，BBR(30、45、60、75、90 μmol·L-1)組均具有顯著性差異，表明BBR可增強足細胞的活力，且呈濃度相關性(P<0.05，P<0.01)。但BBR(75、90 μmol·L-1)組活力較BBR(45、60 μmol·L-1)組減弱，可能與BBR濃度過高產生藥物毒性有關。

2.3 BBR對高糖誘導足細胞凋亡的影響Hoechst染色結果表明，高糖組細胞核較正常組呈致密濃染，且透亮；與高糖組相比，BBR(30、45、60 μmol·L-1)組細胞核濃染減弱且細胞核透亮程度降低(Fig 3)。Fig 4的Annexin V-FITC/PI雙染結果表明，與高糖組相比，BBR(30、45、60 μmol·L-1)組細胞的凋亡率減少(P<0.01)。Fig 5的激光共聚焦顯微鏡結果顯示，與高糖組相比，BBR(30、45、60 μmol·L-1)組caspase-3蛋白表達明顯減少(P<0.05，P<0.01)。

2.4 BBR對高糖誘導足細胞凋亡蛋白的影響Fig 6 和Fig 7的Western blot結果顯示，高糖組caspase-3、6、7、8、9蛋白表達較正常組明顯增加，Bcl-2表達減少(P<0.05，P<0.01)；與高糖組相比，BBR(30、45、60 μmol·L-1)組能不同程度降低caspase-3、6、7、8、9蛋白的表達，減少Bcl-2蛋白的表達(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of BBR for 24 h on podocyte viability induced by high glucose n=3)

##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05,**P<0.01vshigh glucose group.

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的并發癥之一，足細胞損傷和凋亡加速并觸發了糖尿病腎病。研究證明糖尿病腎病終末期腎小球損傷從足細胞損傷凋亡開始，致使腎小管基底膜增厚，腎小管上皮細胞萎縮，引起腎衰竭[11]。因此，干預足細胞的凋亡能夠有效減少腎衰竭。研究表明，高血糖是引起足細胞和內皮細胞損傷的因素之一，可引發多種疾病，如2型糖尿病等。控制血糖，調節細胞的增殖和凋亡對足細胞損傷，減緩腎臟衰竭具有意義[12]。本研究通過體外用高糖對足細胞刺激，發現足細胞凋亡率受高糖濃度影響明顯，10 mmol·L-1的高糖不能誘導足細胞凋亡，高糖濃度超過15 mmol·L-1時，足細胞開始出現凋亡趨勢，增殖緩慢，且這種凋亡比率隨時間的推移而增加。這種現象在一定程度上可反映糖尿病腎病中的足細胞凋亡是一個緩慢進展性過程，為臨床干預足細胞凋亡提供參考價值。BBR是從黃連中提取的天然化合物，對各種慢性疾病具有多種治療活性，具有良好的降糖效果，課題組前期研究已經發現BBR對腎臟的保護作用較為明顯。實驗結果表明，BBR (30、45、60 μmol·L-1)明顯增加了高糖誘導的足細胞活力。為了驗證BBR對足細胞凋亡現象的改善作用，我們用Hoechst染色，Annexin V-FITC/PI雙染和激光共聚焦顯微鏡檢測BBR對高糖誘導的足細胞凋亡的影響，結果表明，BBR能不同程度地降低高糖誘導的足細胞凋亡，對足細胞起保護作用。

Fig 3 Effect of BBR on podocyte apoptosis induced by high glucose Hoechst staining was used to detect the effect of high glucose on podocyte apoptosis.

Fig 4 Effect of BBR on podocyte apoptosis induced by high glucose n=3)

A: Podocyte apoptosis examined using Annexin V-FITC/PI double staining assay; B: Quantitative analysis showed the percentage of the apoptotic podocytes relative to different groups.##P<0.01vsnormal control group;**P<0.01vshigh glucose group.

細胞凋亡的兩種主要方式，一是大量細胞內信號包括缺氧、低血糖、氧化應激以及細胞生長微環境的改變可引起前凋亡蛋白活化及抗凋亡蛋白抑制的線粒體內部途徑，二是外部途徑利用細胞間的死亡配基去活化死亡受體，引起caspase相關蛋白激活的外部途徑[13-15]。研究表明，高糖作用下，細胞內環境發生變化，細胞間的死亡配基去活化，通過死亡受體發出凋亡信號活化caspase-8，引起caspase-3、6、7的酶聯激活反應，可直接降解胞內的結構和功能蛋白，引起凋亡。此外，高糖抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，誘導線粒體釋放細胞色素C，并活化caspase-9，促進caspase-3、6、7的表達，加速細胞進入凋亡程序。BBR作用下，由高糖加速凋亡的兩種途徑受到明顯抑制，結果表明，BBR可能通過影響外部途徑caspase-8/caspase-3和線粒體內部途徑Bcl-2/caspase-9 /caspase-3減少足細胞的凋亡。但caspase凋亡機制錯綜復雜，我們尚未證明，BBR能夠直接作用外部途徑和線粒體內部途徑對高糖誘導的足細胞凋亡起保護作用。因此，后續的實驗我們會通過加入caspase-8和Bcl-2特異性抑制劑，同時對caspase-8和Bcl-2分別進行小分子RNA干擾，從蛋白和基因水平上研究BBR對高糖誘導的足細胞凋亡的作用機制。

A: The positive expression of caspase-3 was detected by laser scanning confocal microscope; B: Quantitative analysis showed the positive expression of caspase-3 relative to different groups.##P<0.01vsnormal control group;*P<0. 05,**P<0.01vshigh glucose group.

Fig 6 Effect of BBR on expression of

##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05,**P<0.01vshigh glucose group.

Fig 7 Effect of BBR on expression of

##P<0.01vsnormal control group;*P<0.05,**P<0.01vshigh glucose group.

綜上所述，本研究揭示了不同高糖環境能在不同時間誘發足細胞凋亡，BBR能緩解高糖誘發的足細胞凋亡，其作用機制可能與caspase-8/caspase-3和Bcl-2/caspase-9 /caspase-3凋亡途徑相關，為臨床進行足細胞凋亡與腎臟損傷干預提供重要的時間參考，為治療糖尿病腎病提供了重要依據。但其具體機制還有待進一步的研究。

(致謝：本實驗完成于中國科學技術大學附屬第一醫院藥劑科藥物基因檢測實驗室，實驗過程中得到實驗室全體老師和同學的幫助。)