二氫楊梅素經激活AMPK-PGC1α-Sirt1信號通路促進高脂飲食誘導的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織棕色化

呂慧婕，羅金定，伍 迪，2，許 拓，何劍琴，楊絲絲，奉水東，凌宏艷

(1.南華大學衡陽醫學院生理學教研室，湖南 衡陽 421000；2.中南大學湘雅醫學院生理學教研室，湖南 長沙 410000；3.南華大學公共衛生學院社會醫學與衛生事業管理學教研室,湖南 衡陽 421000)

隨著生活水平的提升以及生活方式的改變，肥胖人數呈現逐年上升的趨勢[1]。肥胖不僅對人們的健康造成極大的危害，而且給國家及社會帶來沉重的負擔。因此，如何預防和治療肥胖問題一直是科學界研究的熱點。

文獻報道脂肪組織在肥胖及其相關的疾病中具有重要作用。人體內存在兩種不同類型的脂肪組織：白色脂肪組織和棕色脂肪組織[2]。研究顯示：促進白色脂肪組織棕色化，能增加能量消耗從而有效抵抗肥胖。二氫楊梅素(DHM)為野生藤類黃酮類化合物，3,5,7,3’,4’,5’-六羥基2,3二氫黃酮醇，又名蛇葡萄素，存在于葡萄科、滕黃科、楊梅科等植物中，其中在藤茶屬植物中含量最高，具有抗氧化，抗血栓，抗腫瘤，降血糖等作用[3]。研究顯示，DHM可通過激活PPARγ共激活因子1α( peroxisome proliferator activated receptor-γcoactivator-1 α，PGC-1α)改善小鼠骨骼肌胰島素的敏感性[4]，PGC-1α是白色脂肪組織向棕色脂肪組織轉化過程中重要的轉錄調控因子；Liu等[5]發現 DHM可降低肥胖Zucker糖尿病大鼠體質量和肝臟及脂肪組織脂肪沉積，這些研究提示：DHM可能促進WAT棕色化抵抗高脂飲食誘導的小鼠肥胖。為此，本文通過檢測DHM對肩胛下脂肪組織形態，UCP-1、PRDM16、AMPK、PGC-1α和Sirt1的mRNA以及蛋白表達水平的影響，觀察DHM對肥胖小鼠肩胛下脂肪組織棕色化的影響并闡明其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3～4周齡C57BL/6J小鼠,♂,體質量(16～19) g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物使用許可證號：SCXK(湘)2013-0004。小鼠在南華大學動物房(3～5只一籠)適應性喂養一周后，正式開始實驗。動物房12h明暗交替；環境溫度為(23～24) ℃，濕度為0.40～0.60，實驗操作遵照《國家實驗動物健康與管理條例》進行。

1.2 材料二氫楊梅素(DHM) 由張家界志誠生物科技有限公司提供。UCP1和Prdm16兔抗鼠多克隆抗體(Abcam公司)，PGC1α和AMPK兔抗鼠單克隆抗體(Cell Signaling公司)、β-actin和Sirt1兔抗鼠多克隆抗體(Absin公司)。UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1引物由在線軟件primer5設計，上海生工生物工程有限公司合成，Pubmed驗證。

1.3 儀器-80 ℃超低溫冰箱(奧林巴斯生物公司); 定量PCR儀(美國BIO-TEK公司); 高速低溫離心機(其林貝爾生物公司); 蛋白電泳轉膜系統、電泳槽/轉印槽(美國Bio-Rad公司)。

1.4 小鼠肥胖模型的建立和實驗分組C57bl/6j小鼠(60只)適應性喂養1周后，分別普通飼料和高脂飼料喂養，同時用或不用低、高劑量的DHM(125 mg·kg-1·d-1、250 mg·kg-1·d-1)灌胃處理，因此，本實驗共分成6小組：正常對照組(ND組)、正常對照+低劑量DHM組(ND+L-DHM組)、正常對照+高劑量DHM組(ND+H-DHM組)、高脂飲食組(HFD組)、高脂飲食+低劑量DHM組(HFD+L-DHM組)、高脂飲食+高劑量DHM組(HFD+H-DHM組)。每4周測小鼠體質量一次，16周末高脂飼料喂養的小鼠體質量為普通飼料喂養的小鼠體質量的1.2倍，認為小鼠肥胖模型成功建立。

1.6 HE染色肩胛下脂肪組織取肩胛下脂肪組織，置于4 ℃磷酸緩沖液(0.01 mol·L-1PBS，pH 7.3)中洗去血液，在10%甲醛溶液中固定脫水后、浸蠟、包埋、切片、蘇木精染色、200倍顯微鏡下隨機選擇4個視野進行觀察。

1.7 實時定量PCR檢測肩胛下脂肪組織UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1的基因表達取肩胛下脂肪組織，按照說明書提取RNA、逆轉錄合成cDNA，進行PCR擴增。UCP1正義引物：5′-CA CGGGGACCTACAATGCTT-3′，反義引物：5′-ACAGTAAATGGCAGGGGACG-3′(191bp)；Prdm16正義引物：5′-CACGTCTACGGTGAACGGAA-3′，反義引物：5′-ATGGGATCCATGAAGAACGGT-3′(122 bp)；AMPK正義引物：5′-GATGATGACCATGTGCCAACTC-3′，反義引物：5′-TTATTGCGGCCCTCTTCATG-3′(136 bp)； PGC1α正義引物：5′-TGACCACAAACGATGACCCTC-3′，反義引物：5′-GACTGCGGTTGTGTATGGGAC-3′(103 bp)；Sirt1正義引物：5′-CAGCATCTTGCCTGATTTGTAA-3′，反義引物：5′-TGGGGTATAGAACTTGGAATTAGTG-3′(268 bp)；GAPDH正義引物：5′-AGGAGCGAGACCCCACTAACA-3′，反義引物：5′-AGGGGGGCTAAGCAGTTGGT-3′(247 bp)。PCR反應條件為：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s(35 cycle)；72 ℃，7 min。各個基因的相對表達使用2-ΔΔCt計算。

1.8 Western blot檢測肩胛下脂肪組織UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1蛋白表達提取各組小鼠肩胛下脂肪組織總蛋白，經蛋白定量后取30μg蛋白樣品進行電泳, 轉膜、封閉、分別加入抗UCP1、Prdm16、AMPK、PGC1α和Sirt1抗體過夜，洗滌后孵二抗，2 h后充分洗滌后，加ECL化學發光試劑，曝光后掃描，用圖像分析軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 二氫楊梅素對高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體質量影響如Fig 1所示：高脂飼料處理c57bl/6j小鼠16周后，體質量高于正常對照小鼠，提示肥胖模型復制成功。與HFD組比較，HFD+L-DHM組和HFD+H-DHM組小鼠體質量降低，但ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM 3組小鼠體質量差異無顯著性，說明DHM僅僅降低高脂飼料喂養的肥胖小鼠體質量，而對正常小鼠體質量無明顯影響。

Fig 1 Body mass of c57bl/6j mice fed with highfat diet reduced by

*P<0.05vsND group;#P<0.05vsHFD group.

2.2 二氫楊梅素對高脂飲食誘導的肥胖小鼠血糖和Lee’s指數的影響如Fig 2 所示：與ND相比，HFD組血糖和Lee’s指數增高，無論是高劑量還是低劑量的DHM均能降低HFD的小鼠血糖和Lee’s指數。而ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM三組小鼠血糖和Lee’s指數差異無顯著性。

2.3 DHM限制肥胖小鼠肩胛下脂肪組織脂肪細胞變大HE染色結果顯示：與ND組相比，HFD組肩胛下脂肪組織脂肪細胞的直徑增加，而經DHM(125 mg·kg-1·d-1或250 mg·kg-1·d-1)處理的HFD誘導的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織脂肪細胞變小，但ND、ND+L-DHM、ND+H-DHM 3組小鼠肩胛下脂肪組織脂肪細胞大小無差異。提示：DHM可限制高脂喂養的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織脂肪細胞變大。

2.4 DHM對肩胛下脂肪組織UCP1和Prdm16的基因及蛋白表達的影響為觀察DHM能否促進HFD喂養的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織棕色化，我們檢測了各組小鼠肩胛下脂肪組織WAT棕色化因子(UCP1和Prdm16)的基因及蛋白表達。圖4顯示：與ND組比較，HFD組肩胛下脂肪組織UCP1和Prdm16的基因及蛋白表達降低，無論是高劑量還是低劑量DHM均能提高HFD小鼠UCP1和Prdm16的表達；但DHM不影響正常小鼠UCP1和Prdm16的表達。提示：DHM可促進HFD喂養的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織棕色化。

Fig 2 Effect of dihydromyricetin on the blood glucose and Lee’s index in obese mice induced

A:Blood sugar; B:Lee’s index. 1: ND;2:ND+L-DHM;3:ND+H-DHM;4:HFD;5:HFD+L-DHM;6:HFD+H-DHM;#P<0.05vsHFD group.

2.5 DHM對肩胛下脂肪組織AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表達的影響為進一步探討DHM促進HFD喂養的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織棕色化的機制，小鼠肩胛下脂肪組織AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表達被檢測。如圖5所示：與ND組比較，HFD組肩胛下脂肪組織AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表達水平下降；與HFD組比較，HFD+L-DHM和HFD+H-DHM組肩胛下脂肪組織AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表達水平升高，但DHM不影響正常小鼠AMPK、PGC1α和Sirt1 mRNA及蛋白表達。提示：DHM可能通過激活AMPK-PGC1α-Sirt1信號通路促進HFD喂養的肥胖小鼠肩胛下脂肪組織棕色化。

Fig 3 Effect of dihydromyricetin on size of subscapular fat cellsin high fat diet induced obese n=4)

A：Subscapular fat HE staining(20×); B:Subscapular fat cell size; 1: ND;2:ND+L-DHM;3:ND+H-DHM;4:HFD;5:HFD+L-DHM;6:HFD+H-DHM.*P<0.05vsND group;#P<0.05vsHFD group.

3 討論

據統計現今全世界肥胖及超重的人數已達21億，接近全世界總人口的30%，而中國已成為世界的第二大“肥胖國”[6]，其肥胖人數僅次于美國[7]。因此，肥胖問題亟待解決。目前對肥胖的治療主要是改變生活方式、藥物和手術治療[8]。改變生活方式常常由于病人無法堅持而失敗[9]，手術治療存在極大的手術風險，而藥物治療雖然在一定程度上可靠，但由于其毒副作用較大限制其使用[10]。因此，尋找安全、毒副作用少的減肥藥物一直是科學家們的追求。

傳統的觀點認為：哺乳動物體內存在兩種不同類型的脂肪組織，白色脂肪組織(white adipose tissue，WAT)和棕色脂肪組織。WAT能將體內的能量以脂肪形式儲存起來，當能量攝入超過能量消耗時，WAT將會在體內堆積，從而引發肥胖。棕色脂肪組織內含許多線粒體，線粒體膜上存在大量解耦聯蛋白UCP1，UCP1能將葡萄糖和脂肪分解[11]。因此，棕色脂肪組織可燃燒脂肪，具有減肥作用。因此，若能促進肥胖患者體內的WAT轉變成棕色脂肪組織，將促進體內能量消耗，從而達到減肥的目的，這無疑給肥胖治療帶來福音。

Fig 4 Effect of dihydromyricetin on the mRNA and protein expression of UCP1 and Prdm16 in high fat diet

1:ND；2：HFD；3：HFD+L-DHM；4：HFD+H-DHM.*P<0.05vsND group;#P<0.05vsHFD group.

二氫楊梅素(DHM)為藤類植物黃酮類化合物，具有多種藥理學作用，大量文獻表明DHM具有降糖、降脂和抗腫瘤等作用[12-13]。我們在前期預實驗中發現，經DHM處理過的2型糖尿病小鼠皮下脂肪組織出現肉眼可見的棕色化改變，但DHM是否可促進WAT棕色化從而抵抗肥胖，還未見文獻報道。因此，本實驗通過高脂飲食喂養小鼠復制肥胖小鼠模型，觀察DHM對肥胖小鼠的體質量、血糖、Lee’s指數、肩胛下脂肪細胞的形態及大小和棕色化因子UCP1, Prdm16的基因及蛋白表達的影響。結果顯示：與ND組比較，HFD組小鼠體質量、血糖、Lee’s指數和肩胛下脂肪組織脂肪細胞直徑明顯增加，UCP1、Prdm16基因及蛋白表達明顯降低；DHM可明顯逆轉HFD小鼠上述指標的改變，但DHM對正常小鼠無影響。提示DHM可促進肩胛下脂肪組織棕色化，抵抗高脂飲食誘導的肥胖。那么，DHM促進肩胛下脂肪組織棕色化的機制是什么呢？

Fig 5 Effect of dihydromyricetin on the mRNA and protein expression of AMPK, PGC1α and Sirt1 in obese mice induced by high fat n=3)

1:ND；2：HFD；3：HFD+L-DHM；4：HFD+H-DHM.*P<0.05vsND group;#P<0.05vsHFD group.

長期以來，人體內的棕色脂肪被認為僅存在于嬰幼兒時期。近年的研究顯示，成人體內亦有少量棕色脂肪存在。人體內的棕色脂肪主要分布于肩胛間、腋窩下、腎周及脊柱旁。因此，本文選擇肩胛下的脂肪組織作為研究對象。另有研究顯示，“WAT棕色化”有關的作用靶點是PGC1α，AMPK是PGC1α的重要調節因子[2]。又有文獻報道：DHM可經AMPK-PGC1α-Sirt1信號通路提高小鼠骨骼肌胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗[4]。提示：DHM可能通過AMPK-PGC1α-Sirt1信號通路來促進肩胛下脂肪組織棕色化抵抗高脂飲食誘導的肥胖。因此，我們通過實時定量PCR和WB 檢測了各實驗組小鼠肩胛下脂肪組織中AMPK、PGC1α和Sirt1mRNA和蛋白表達，結果顯示：HFD組中AMPK、PGC1α和Sirt1mRNA和蛋白表達水平低于ND組，但DHM對正常小鼠這些基因及蛋白表達無影響。

綜上所述，我們推測DHM可通過AMPK-PGC1α-Sirt1信號通路促進肩胛下脂肪組織棕色化抵抗高脂飲食誘導的肥胖，為DHM減肥提供了新的途徑和策略，為肥胖相關的代謝綜合征也帶來新的治療方案。

(致謝：本實驗在南華大學神經生理研究所以及南華大學實驗動物中心完成，衷心感謝各位老師的支持與幫助。)