毛蕊異黃酮抑制氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞凋亡研究

張彐寧,靳曉飛,周曉紅,張 穎,高維娟

(河北中醫學院河北省心腦血管病中醫藥防治研究重點實驗室，河北 石家莊 050091)

缺血性中風，又稱腦梗塞，是指因缺血缺氧導致腦血流不足以維持正常功能，而導致腦血管梗塞或腦組織壞死的一類疾病[1]。缺血性中風往往造成患者失語、偏癱、癡呆等后遺癥，給患者家庭和社會帶來巨大的經濟負擔和心理壓力。目前，血流的早期恢復是治療缺血性中風的最佳方法，但恢復血流有時可加劇腦組織損傷和神經功能障礙，并引起嚴重的病理反應——腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷[2]。CIR引發神經元死亡的發生機制較為復雜，細胞凋亡(apoptosis)被認為是引起CIR神經元死亡的重要原因之一，通過抑制細胞凋亡減輕CIR損傷，對增加缺血性中風的治療機會具有重要意義[3]。中藥黃芪具有補氣活血之功效，被歷代醫家用來治療缺血性中風，并取得良好效果。毛蕊異黃酮是黃芪的主要活性成分之一，是黃芪黃酮類的單體成分，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、延緩衰老等生物作用[4]。本課題組前期觀察了不同劑量的毛蕊異黃酮對氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞的影響，結果發現不同劑量毛蕊異黃酮均可改善PC12細胞生長狀態，提高細胞存活率，但其具體作用機制尚不明確。本實驗應用氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞模型，模擬體外CIR損傷環境，探討毛蕊異黃酮拮抗氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞損傷的凋亡作用機制。

1 材料

1.1 細胞PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系，經NGF誘導后，高分化具有交感神經元特性，批號：CX0247)購于BOSTER公司。

1.2 主要試劑毛蕊異黃酮(上海士峰生物制品有限公司，20mg /瓶，純度≥98% ，批號：18060411)；CCK-8試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司，批號：70A11D)；尼莫地平(批號：DN0045)、Bax(批號：GB11007)和Bcl-2(批號：GB12008)一抗、Alexa Fluor488(批號：GB25301)和Cy3熒光(批號：174835)二抗均購自武漢賽維爾生物公司；caspase-3抗體(Gene Tex公司，批號：GTX110543)；AnnexinV FITC/PI雙染色流式細胞術試劑盒(BD公司，批號：556547)；TUNEL染色試劑盒(Roche公司，批號：30967400)；二甲基亞砜(DMSO)(東京化成工業株式會社，批號：8KZ4ATP)；Triton X-100(批號：1109F0512)、青鏈霉素混合液(批號：20180706)、多聚賴氨酸(批號：P2100)均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批號：20171115)；Earle’s平衡鹽溶液(安徽雷根生物技術有限公司，批號：1019A18)；DMEM高糖培養基(批號：8118192)、1×PBS緩沖液(批號：8117042)均購自賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司。

1.3 主要儀器SW-CJ-ID型超凈工作臺購自蘇州凈化公司；DPX-9052B-1型電熱恒溫培養箱購自上海福瑪實驗設備有限公司；3111型二氧化碳(CO2)培養箱、Multiskan FC型酶標儀、3131型三氣培養箱均購自美國Thermo公司；Axio Observer 7型倒置熒光顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；多功能成像系統購自Vilber公司；流式細胞儀FC 500 MCL型購于Beckman公司。

2 方法

2.1 細胞培養PC12細胞用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)置于5%CO2、濕度適宜、37℃的CO2培養箱內進行培養，當細胞密度生長至80%時進行傳代。

2.2 實驗分組、模型建立和給藥實驗分為4組：正常對照組(Control)、氧糖剝奪/復氧復糖(OGD/R)組(Model)、毛蕊異黃酮組(Calycosin，0.07 μmol·L-1)、尼莫地平組(Nimodipine，5.00 μmol·L-1)。除Control組外，其它各組均氧糖剝奪2 h后復氧復糖24h，建立 OGD/R細胞模型：棄去正常細胞培養液，用PBS清洗細胞2遍，換為無糖Earle’s細胞培養液，模擬細胞缺血狀態，隨后立即將細胞放入三氣培養箱(37℃，94%N2+1%O2+5%CO2，濕度適宜)，氧糖剝奪2 h處理，然后更換回正常細胞培養液，放入CO2培養箱中繼續培養24 h。Control組正常培養，不做其他任何處理；Calycosin組和Nimodipine組在復氧復糖的同時分別給予含有毛蕊異黃酮(作用濃度為0.07 μmol·L-1)、尼莫地平(作用濃度為5.00 μmol·L-1)的含藥培養基處理，直至細胞培養結束。

2.3 CCK-8檢測各組細胞存活率將上述PC12細胞以1×105個·mL-1單層接種于96孔板，每組設置6個復孔，除Control組外，其余各組細胞進行造模處理，造模給藥處理后各組細胞每孔加入10μL CCK-8試劑，于細胞培養箱內孵育50min，取出各組細胞，酶標儀檢測各孔450 nm波長下的吸光(OD)值。細胞存活率/%=(實驗組OD值-空白組OD值)/(正常組OD值-空白組OD值)×100%。

2.4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率取上述相同處理方式的細胞單層接種于6孔板中，造模、給藥處理后，取出各組細胞，分別收集各組細胞上清液，用胰蛋白酶消化細胞，1500 r·min-1離心5 min，用提前預冷的PBS清洗細胞2遍，100μL 1×Binding Buffer重懸細胞，每組細胞加入FITC和PI各5μL，室溫避光反應15min，加入400 μL 1×Binding Buffer，上機檢測各組細胞凋亡率。

2.5 TUNEL染色檢測各組細胞凋亡指數將上述PC12細胞以1×105個·mL-1單層接種于6孔板中，造模完成后，將各組細胞爬片取出，用多聚甲醛溶液固定25min，洗去固定液，加入50～100μL含0.2%Triton X-100溶液于每個爬片上，室溫透膜20 min，H2O2室溫處理細胞5 min，加入TUNEL反應混合液50 μL(TdT ∶dUTP=1 ∶9)，Control組只加入50 μL dUTP液，避光37℃孵育60 min，滴加50 μL converter-POD于細胞爬片，避光37℃孵育30min，隨后滴加100 μL DAB，避光室溫孵育10min，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，陽性細胞(即凋亡細胞)細胞核被染為棕黃色，顯微鏡下每組細胞隨機選取6個視野，觀察各組細胞凋亡情況。凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數。

2.6 免疫熒光染色檢測各組細胞Bax/Bcl-2比值各組細胞爬片、固定、破膜同上，細胞破膜后，加入4%BSA室溫封閉30min，甩掉封閉液后，滴加配好的Bax多克隆抗體(1 ∶100)和Bcl-2單克隆抗體(1 ∶100)50～100 μL于爬片上，濕盒內4℃過夜，洗去一抗，滴加山羊抗小鼠IgG(1 ∶300)和驢抗兔IgG(1 ∶200)二抗，室溫避光孵育60 min，洗去二抗，滴加DAPI染液室溫避光10 min，封片，熒光顯微鏡下隨機選取6個視野，觀察各組細胞的熒光表達。Bax為紅色熒光，Bcl-2為綠色熒光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析Bax與Bcl-2的熒光強度值，并計算Bax/Bcl-2比值。

2.7 Western blot檢測各組細胞caspase-3蛋白表達造模給藥處理后，分別收集各組PC12細胞，用預冷PBS 洗滌2遍，加入RIPA 細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，震蕩混勻，高溫變性10 min，SDS-PAGE 電泳分離，濕轉1.5 h，室溫奶粉封閉2 h，滴加caspase-3一抗(1 ∶1000)，4℃過夜，TBST洗去一抗，滴加二抗(1 ∶2500)室溫孵育1 h，TBST洗去二抗，配制ECL發光液，置于多功能成像系統中掃描成像，采用Image J軟件對Western blot條帶進行分析，分析目的條帶/對應內參的相對表達量。

3 結果

3.1 CCK-8檢測各組細胞存活率的結果如Fig 1所示，與Control組相比，給予氧糖剝奪/復氧復糖處理后，Model組細胞存活率明顯降低(P<0.05)，提示氧糖剝奪/復氧復糖引起PC12細胞損傷；與Model組相比，Calycosin組和Nimodipine組細胞存活率均明顯升高(P<0.05)，差異有統計學意義。

Fig 1 Viability of cells in each group

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

3.2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率的結果如Fig 2所示，與Control組相比，給予氧糖剝奪/復氧復糖處理后，Model組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，Calycosin 組和Nimodipine組細胞凋亡率均明顯降低(P<0.05)，差異有統計學意義。

3.3 TUNEL染色檢測各組細胞凋亡指數的結果如Fig 3所示，與Control組相比，給予氧糖剝奪/復氧復糖處理后，Model組出現細胞核被棕染的陽性凋亡細胞，細胞凋亡指數明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，Calycosin 組和Nimodipine組細胞凋亡指數均明顯降低(P<0.05)，差異有統計學意義。

3.4 免疫熒光染色檢測各組細胞Bax/Bcl-2比值的結果如Fig 4所示，與Control組相比，給予氧糖剝奪/復氧復糖處理后，Model組Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，Calycosin 組和Nimodipine組Bax/Bcl-2比值均明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡程度明顯減輕，差異有統計學意義。

3.5 Western blot檢測各組細胞caspase-3蛋白表達的結果如Fig 5所示，與Control組相比，給予氧糖剝奪/復氧復糖處理后，Model組caspase-3蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與Model組相比，Calycosin組和Nimodipine組caspase-3蛋白表達明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡程度明顯減輕，差異有統計學意義。

Fig 2 Apoptotic rate of each group detected by flow cytometry n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

4 討論

關于缺血性中風的治療，臨床上多采用溶栓療法和外科手術來恢復缺血區的血流供應，但恢復血流的同時產生的CIR損傷也逐漸成為臨床上的難題[2]。CIR損傷的發生機制十分復雜，主要涉及細胞凋亡、自噬、氧化應激、炎性反應等因素的影響，各因素之間相互作用，最終導致神經細胞死亡[5]。細胞凋亡是指在體內外多種因素的誘導下，由嚴格和復雜的信號網絡調控而發生的自主性細胞有序死亡過程[6]。細胞凋亡是CIR損傷病理進程中的重要環節，再灌注引起的神經細胞死亡以細胞凋亡為主，其主要在缺血病灶的周圍半暗帶區域發生，神經功能障礙的嚴重程度、腦梗死體積的大小均與其密切相關[7,8]。因此，有效抑制細胞凋亡的發生對于減輕CIR損傷具有重要意義。

腦缺血/再灌注后，各種內外因素的刺激，使位于線粒體內、外膜的通透轉換孔PTP開放，CytC、AIF等促凋亡物質由線粒體膜間隙釋放入胞質，與胞質中的凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1結合，同時與Procaspase-9形成凋亡酶體復合物，即凋亡小體，進而激活caspase-3，引起caspase連鎖反應，使細胞走向凋亡[9]。在此過程中，Bcl-2蛋白家族發揮了重要作用，其中Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族里面重要的凋亡調控蛋白，而caspase-3在凋亡發生的執行過程中發揮了關鍵作用。當細胞受到缺血等刺激時，位于胞質中的Bax向線粒體膜聚集，促使線粒體膜通透性改變，進而釋放CytC，導致caspase-3活化，最終誘導細胞凋亡；而Bcl-2作為一種與線粒體相關的膜穩定蛋白，能夠維持和保護膜的穩定性，與Bax形成異源二聚體，抑制caspase-3活化，阻止細胞凋亡的發生[10]。由此可見，Bax、Bcl-2、caspase-3在細胞凋亡的發生發展過程中發揮著關鍵作用，其三者常作為檢測細胞凋亡的重要參考指標。

Fig 3 Apoptotic index of each group detected by TUNEL staining n=6) (scale bar=20μm)

Arrow indication: Positive cell. Damaged cells after OGD/R, the nucleus was stained brown.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

Fluorescent images : green, Bcl-2; red, Bax; blue, DAPI.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

Fig 5 Protein expression of caspase-3 of each group detected by Western blot n=6)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel.

黃芪始載于《神農本草經》，被譽為補氣圣藥，具有補氣活血、行滯通痹之功效，被歷代醫家用治氣虛血滯，半身不遂，痹痛麻木等癥[11]，并取得良好效果。黃芪治療中風的歷史較為悠久，清代醫家王清任更是重用黃芪，以黃芪為君藥首創治療缺血性中風的名方——補陽懷五湯，收到了良好的臨床效果，并且一直被臨床上沿用至今。現代藥理學研究發現，黃芪的主要成分有：黃酮類、皂苷類、多糖類三種，研究已證實，黃芪三大成分在調控自噬、抗炎、抗氧化、調節血壓、促進干細胞增值、改善認知功能障礙等方面發揮著重要作用[12]。毛蕊異黃酮為黃芪黃酮類的單體成分，近年來開始受到更多的關注，研究發現毛蕊異黃酮具有調控自噬、調節鈣穩態、抗氧化、延緩衰老、促進細胞增殖、抗炎等生物作用[13,14]。Liu等[15]探討了毛蕊異黃酮對氧化應激誘導的缺血性心臟病心肌細胞凋亡的影響，結果證實毛蕊異黃酮以劑量依賴性方式降低H2O2的表達，增強心肌細胞中Akt磷酸化而表現出抗細胞凋亡作用。那么，毛蕊異黃酮在腦缺血再灌注損傷中是否同樣具有抑制細胞凋亡、拮抗腦損傷的作用？尚缺乏研究。

本課題組前期研究發現，不同劑量的毛蕊異黃酮均可明顯改善氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞的生長狀態，提高細胞存活率，明顯減輕細胞損傷，發揮保護作用。本實驗在前期研究的基礎上，選取毛蕊異黃酮最佳作用劑量，通過建立氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞模型，在細胞水平，觀察毛蕊異黃酮對氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞凋亡的影響，探討毛蕊異黃酮拮抗腦缺血再灌注損傷的凋亡作用機制。實驗結果發現，PC12細胞給予氧糖剝奪/復氧復糖處理后，細胞存活率明顯降低，細胞凋亡率和凋亡指數均明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高，Bax/Bcl-2比值升高，凋亡蛋白caspase-3表達明顯升高；而當分別給予毛蕊異黃酮和尼莫地平處理后，PC12細胞存活率明顯升高，細胞凋亡率和凋亡指數均降低，Bax/Bcl-2比值和凋亡蛋白caspase-3表達均明顯降低，表明毛蕊異黃酮可提高氧糖剝奪/復氧復糖PC12細胞存活率，抑制細胞凋亡，發揮保護作用，其分子機制與毛蕊異黃酮調控凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達密切相關。