紫草素通過(guò)Smad3/Erbb4-IR軸對(duì)腎臟纖維化的抑制作用研究

廖 媛，李健春，譚睿陟，張宇韋，王 麗，樊均明.3

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 1.腎病內(nèi)科, 2.中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川 瀘州 646000; 3.成都醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610000)

慢性腎臟(chronic kidney disease，CKD)作為一個(gè)全球的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題, 嚴(yán)重威脅著公眾健康[1]。而纖維化是導(dǎo)致終末期器官疾病(包括慢性腎病)的標(biāo)志和共同途徑, 故抑制腎臟纖維化是延緩CKD病情發(fā)展的關(guān)鍵[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是一種促纖維化細(xì)胞因子, TGF-β通過(guò)與TGF-βⅡ型受體結(jié)合而啟動(dòng)其跨多種細(xì)胞類型的促纖維作用, 該受體激活TGF-βⅠ型受體, 導(dǎo)致Smad2/3的磷酸化, 然后激活的Smad3復(fù)合物易位到細(xì)胞核并調(diào)節(jié)促纖維化基因的轉(zhuǎn)錄, 如I型膠原蛋白(Col I )，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，從而對(duì)CKD的進(jìn)展發(fā)揮致纖維化作用[3,4]。

目前尚無(wú)可用于減輕腎纖維發(fā)生和保持器官功能的治療藥物，抑制TGF-β/ Smad途徑的替代方法可能是一種能有效減輕腎纖維化而又不損害免疫系統(tǒng)功能的重要選擇[5]。Erbb4-IR是一種新的長(zhǎng)非編碼RNA(long noncoding RNA,，lncRNA),是TGF-β/Smad3信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)子,由TGF-β1通過(guò)Smad3依賴性機(jī)制誘導(dǎo),并且在小鼠單側(cè)輸尿管梗阻性腎病(unilateral ureteral obstructive nephropathy，UUO)纖維化腎中高度上調(diào)。而Smad7是TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)的下游負(fù)調(diào)節(jié)因子。有研究發(fā)現(xiàn),用Smad3特異性抑制劑(SIS3)處理能夠預(yù)防小鼠腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的Erbb4-IR表達(dá)，而Erbb4-IR的過(guò)表達(dá)在很大程度上可以抑制Smad7,而沉默Erbb4-IR可以阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的膠原蛋白I和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)在體外的表達(dá),可有效減輕腎臟纖維化[6-8]。紫草素(Shikonin，SHI)是從紫草根中提取的一種化合物,具有抗氧化,抗炎,抗癌和促進(jìn)傷口愈合的特性[9], 已有文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)肝臟、肺纖維化有較好的治療作用,但關(guān)于其在腎臟纖維化中研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究擬觀察紫草素對(duì)慢性腎臟纖維化小鼠的作用，并通過(guò)檢測(cè)紫草素對(duì)TGF-β/Smad3/Erbb4-IR信號(hào)軸的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和環(huán)境 SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司, 許可證號(hào):SYXK(川)2018-065, 飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 在溫度22 ℃左右、濕度65%左右的環(huán)境中生長(zhǎng)。

1.1.2藥物和試劑 紫草素購(gòu)于成都purify公司, GoScriptTMReverse Transcription System(A5001) 購(gòu)于Promega公司, 抗體p-smad3(1 ∶1 000, 9520S)、Smad3(1 ∶1 000,9513S)均購(gòu)于CST, FN購(gòu)于DSHB(1 ∶1 000, P1H11), Smad7購(gòu)于Santa Cruz(1 ∶500, sc365846), α-SMA購(gòu)于Invitrogen(AB-2572995), 高碘酸-希夫反應(yīng)(periodic acid-Schiff stain, PAS)試劑盒購(gòu)于Solarbio(Beijing, G1281), MASSON染色購(gòu)于BASO(珠海, BA4079B), 肌酐測(cè)定試劑盒(C011-2)、尿素氮測(cè)試盒(C013-2)均購(gòu)于南京建成。

1.1.3主要儀器 Light CyclerR 480II PCR儀, Thermo Fisher 分光分度計(jì), Thermo Fisher PCR儀, 儀器均來(lái)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 將30只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO組、紫草素低(5 mg·kg-1)、高劑量組(20 mg·kg-1)、厄貝沙坦組(20 mg·kg-1)。 除假手術(shù)組外, 其余各組均接受單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)，在手術(shù)前1 h, 治療組給予藥物灌胃處理，以后每天給藥1次, 10 d后處死，眼球取血，4 ℃過(guò)夜。剖取右腎，剝離包膜并用PBS沖洗，一部分腎組織放于凍存管中迅速置于液氮罐儲(chǔ)存?zhèn)浞肿由飳W(xué)檢測(cè), 另一部分置于10 % 甲醛溶液中固定保存, 脫水后制作成石蠟塊。

1.2.2血清肌酐尿素氮檢測(cè) 收集各組小鼠血，4 ℃放置過(guò)夜后, 3 000 rpm, 離心15 min后, 收集血清，血清肌酐、尿素氮檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3腎臟形態(tài)學(xué)檢查 切片于65 ℃烘箱烘烤1.5 h，梯度脫蠟復(fù)水。HE、PAS染色、MASSON染色嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作。光鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)病理改變，MASSON染色觀察腎組織的纖維化病變。腎小管損傷率計(jì)算公式：同一鏡下腎小管損傷數(shù)與總腎小管數(shù)的比值,此處我們?nèi)×?個(gè)鏡下。

1.2.4IHC和Western blot檢測(cè) IHC檢測(cè)α-SMA的表達(dá)：切片常規(guī)處理后, 滴加過(guò)氧化氫阻斷劑10 min, 5%BSA封閉15 min, 滴加一抗(1 ∶150), 4 ℃過(guò)夜, 加二抗后常溫孵育1 h, 曝光。各組腎臟剪碎后加RIPA和PMSF(1 ∶10)混合物在冰上裂解40 min后，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)濃度，加5×loading buffer后于100 ℃煮10 min，等量蛋白液上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離，用PVDF膜轉(zhuǎn)膜，用5 % BSA封閉1 h后，孵一抗, 4 ℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗搖床孵育1 h，以ECL發(fā)光液檢測(cè)。

1.2.5TGF-β和Erbb4-IR基因檢測(cè) 取各組腎臟組織40 mg, 用滅菌后的剪刀剪碎組織, 直至肉眼不可見(jiàn)大塊組織, 運(yùn)用 RNA simple Total RNA Kit(Beijing Tian Gen，Q5905)試劑盒從腎中提取總RNA, 最后加入30 μL 無(wú)RNA酶雙蒸水, 混勻, Thermo Fisher NANODROP 2000分光分度計(jì)上檢測(cè)RNA濃度, 按照Go ScriptTMReverse Transcription System(Promego, A5001, USA)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。cDNA合成反應(yīng)體系為：RNA 2 μg、Random Primer 1 μL、Primer Oligo(dT)1 μL、Nuclease-Free Water 定容到5 μL, 混勻離心, 70 ℃ 5 min, 冰上放置5 min，離心10 s。使用Go ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的以下組分制備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物,反應(yīng)體系組成為：5×Reaction Buffer 4 μL、MgCl2(final concentration 2.5 mmol·L-1) 1.5 μL、PCR Nucleotide Mix 1 μL、Go ScriptTMReverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water 7.5 μL，輕輕混合, 并在逆轉(zhuǎn)錄之前保持在冰上。將cDNA 5 μL和逆轉(zhuǎn)錄體系15 μL混合在一起, 離心后25 ℃ 5 min, 42 ℃ 1 h, 70 ℃ 15 min，反應(yīng)完畢加入80 μL Nuclease-Free Water稀釋樣品, -20 ℃保存?zhèn)溆谩ight CyclerR 480 II上檢測(cè)Erbb4-IR、TGF-β, 引物信息如表1，靶基因的mRNA表達(dá)水平針對(duì)GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化。

Tab 1 The primer sequences of mouse Erbb4-IR and TGF-β

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析, 數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA), 方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況各組小鼠活動(dòng)正常, 無(wú)死亡現(xiàn)象, 模型組小鼠體重較假手術(shù)組增長(zhǎng)緩慢；紫草素低、高劑量組及厄貝沙坦組小鼠體重相比模型組均有明顯改善。

2.2 肌酐、尿素氮檢測(cè)紫草素低、高劑量組的肌酐和尿素氮均有下降, 且高劑量組的尿素氮低于厄貝沙坦組, 差異有顯著性。

2.3 腎組織結(jié)構(gòu)改變HE染色可以看出, 模型組腎臟腎小管上皮細(xì)胞萎縮, 出現(xiàn)較多空泡, 無(wú)完整腎臟結(jié)構(gòu)，且有較多炎性細(xì)胞出現(xiàn), 紫草素的治療可明顯改善腎小管損傷狀態(tài), 空泡減少, 炎性細(xì)胞減少, 且紫草素高劑量組優(yōu)于厄貝沙坦組。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Renal function and renal pathological damage significantly improved by shikonin in UUO mice

2.4 各組小鼠右腎的纖維化改變MASSON染色顯示, UUO模型組藍(lán)色纖維化區(qū)域較假手術(shù)組增多, 和模型組相比, 紫草素治療組纖維組織成分明顯減少。IHC結(jié)果顯示, UUO組的α-SMA表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng);紫草素高劑量組的α-SMA表達(dá)較UUO組明顯減少。Western blot結(jié)果顯示, UUO組α-SMA和FN蛋白明顯增加, 紫草素治療組其蛋白表達(dá)下降, 紫草素高劑量組表現(xiàn)更為明顯。見(jiàn)Fig 2。

2.5 小鼠腎臟p-Smad3、Smad7和Erbb4-IR、TGF-β的表達(dá)Real-Time PCR結(jié)果顯示, UUO組腎臟組織Erbb4-IR表達(dá)較假手術(shù)組增多, TGF-β的mRNA表達(dá)也明顯增多。紫草素治療低、高劑量組和厄貝沙坦組Erbb4-IR的表達(dá)較模型組減少, TGF-β mRNA表達(dá)也減少, 紫草素高劑量更為明顯。p-Smad3蛋白在假手術(shù)組腎臟中表達(dá)極少, UUO成模10 d后，p-Smad3蛋白表達(dá)增多, 而Smad7蛋白表達(dá)下降。經(jīng)過(guò)紫草素治療后, p-smad3的表達(dá)下降, Smad7表達(dá)增高, 在紫草素高劑量組表現(xiàn)尤為明顯。見(jiàn)Fig 3。

3 討論

腎纖維化是多種慢性疾病的一致病理轉(zhuǎn)歸，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜, 由于缺乏可用的治療選擇，終末期慢性腎病目前通過(guò)透析或移植腎替代療法治療。TGF-β1作為一種公認(rèn)的促腎纖維化細(xì)胞因子，受到各種病理性因素(缺血、缺氧或高糖等)和外界環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生，可刺激成纖維細(xì)胞、MFB及EMT合成并分泌ECM[10,11]。

紫草素,一種來(lái)源于干燥的根中天然產(chǎn)物，有較好的抗纖維化作用。近年來(lái)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，紫草素可減輕α-SMA在人皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)[12]。本研究通過(guò)建立梗阻性腎病纖維化模型來(lái)探討紫草素對(duì)腎纖維化的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。研究結(jié)果顯示在造模10 d后腎臟體積增加, 腎皮質(zhì)變薄, 腎臟內(nèi)積水較多，而紫草素治療組可顯著緩解腎臟病變, 病理結(jié)果也顯示紫草素治療組可顯著緩解腎功能損傷,改善腎小管損傷,明顯降低了α-SMA、FN蛋白的表達(dá)，改善了腎臟纖維化，提示紫草素具有一定的抗腎纖維化效果, 但具體機(jī)制尚不清楚。Smad3受TGF-β1刺激活化，是誘發(fā)纖維化的核心調(diào)控因子，但有研究表明，Smad3基因缺失可能破壞免疫系統(tǒng)而誘發(fā)自身免疫性疾病，因此，直接抑制Smad3可能并不是一種理想的緩解TGF-β1介導(dǎo)腎纖維化的方法，而調(diào)控Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(如抑制Smad3靶基因)可能是一種更佳的治療策略。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸、不編碼蛋白的RNA分子，前期研究證實(shí), lncRNA的異常表達(dá)與多種病理環(huán)境相關(guān)，比如癌癥、代謝和心血管疾病。近期研究結(jié)果顯示，通過(guò)使用高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)lncRNA在慢性腎病小鼠模型中具有差異表達(dá), 與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)Erbb4-IR是一種新的腎臟特異性Smad3依賴性長(zhǎng)鏈非編碼RNA，位于Erbb4基因的1號(hào)和2號(hào)外顯子之間的內(nèi)含子非編碼RNA[6], 已被研究證明在腎臟纖維化、癌癥以及細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用。Erbb4-IR受Smad3活化后產(chǎn)生，是Smad3下游重要靶基因之一，其通過(guò)下調(diào)Smad7而作用于TGF-β/ Smad3介導(dǎo)的腎纖維化。因此，通過(guò)抑制長(zhǎng)鏈非編碼Erbb4-IR的表達(dá)進(jìn)而減緩纖維化是一種有效的治療方法。在本課題中我們發(fā)現(xiàn)Smad3蛋白磷酸化水平和長(zhǎng)鏈非編碼Erbb4-IR表達(dá)在UUO模型組中明顯升高, 表明纖維化調(diào)控因子Smad3在UUO模型中已經(jīng)被激活, 誘發(fā)了纖維化, 同時(shí)其下游靶基因Erbb4-IR也給予回復(fù), smad3蛋白轉(zhuǎn)錄增加, 表達(dá)上調(diào), 會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性與TβR-I結(jié)合, 反饋性地抑制Smad7的表達(dá)。在給藥10天后，Smad3蛋白磷酸化水平表達(dá)明顯下調(diào)，表明紫草素可以抑制纖維調(diào)控因子的表達(dá)，同理Smad7表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明紫草素可以通過(guò)平衡Smad3和Smad7而達(dá)到抑制纖維化的作用。值得注意的是，紫草素治療后也可明顯抑制Smad3下游靶基因Erbb4-IR的表達(dá), 據(jù)此初步我們可以得出紫草素可以通過(guò)減少長(zhǎng)鏈非編碼RNA Erbb4-IR來(lái)抑制Smad3、促進(jìn)Smad7的表達(dá)從而減輕腎臟纖維化, 這可能是紫草素保護(hù)CKD的新機(jī)制。但在本研究中，Erbb4-IR在腎臟損傷中的確切作用尚需細(xì)胞水平的驗(yàn)證，機(jī)制探討也需進(jìn)一步深入研究。

Fig 2 Renal fibrosis induced by UUO significantly reduced by shikonin in mice

Fig 3 Fibrosis induced by UUO improved by shikonin in mice by reducing Smad3/Erbb4 axis

綜上所述, 紫草素可通過(guò)降低Smad3下游靶基因Erbb4-IR的表達(dá)來(lái)抑制TGF-β/Smad3介導(dǎo)的腎臟纖維化，發(fā)揮良好的抗纖維化作用, 這對(duì)紫草素的腎保護(hù)機(jī)理與臨床運(yùn)用起到很好的指導(dǎo)作用。