TLR9基因敲除小鼠的構建及表型初步鑒定

龐米米，林 涵，李雨佳，許娜娜，潘 越，聶雪珂，陳 慧，萬紹貴，鮑登克

(河南大學藥學院，河南省人民醫院，河南 開封 475000)

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)家族是一類重要的模式識別受體，通過識別病原體相關分子模式參與先天性免疫進程，在天然免疫中發揮關鍵作用[1]。作為TLRs家族的重要成員之一，TLR9在人類疾病發生進展中扮演著重要的角色。TLR9主要表達于免疫細胞，如B淋巴細胞、樹突細胞、中性粒細胞、單核細胞等。TLR9通過識別細菌和病毒DNA中非甲基化CpG基序，誘導產生強烈的Th1優勢免疫應答，調節IFN-α、IL-6、IL-12等細胞因子分泌，參與抵抗缺血/缺氧性腦損傷、自身免疫性疾病、炎癥相關疾病的發生[2-3]。近年來研究發現，TLR9在肺癌、胃癌、卵巢癌、結腸癌多種腫瘤細胞中高表達，可能與惡性腫瘤發生發展密切相關[4-6]。TLR9激活后可通過NF-кB與JNK信號轉導途徑，誘導促炎癥細胞因子及免疫抑制分子分泌而形成炎性環境，同時腫瘤細胞分泌的免疫抑制分子如MMP2、MMP7、COX-2等均會對腫瘤細胞逃避機體的免疫監視起重要作用，促進腫瘤生長[7]。TLR9在腫瘤免疫中發揮重要作用，已經成為腫瘤免疫治療研究的熱點之一。因此，研究TLR9蛋白功能對我們了解免疫、炎癥相關性疾病和腫瘤的發生機制具有重要意義。采用基因敲除小鼠來研究TLR9功能及在相關疾病進展中的作用，相比其他研究方法能排除內源性基因的干擾，而且實驗結果直觀，可靠。本課題組擬利用CRISPR-Cas9技術構建TLR9基因敲除小鼠，并初步研究TLR9基因敲除對小鼠遺傳表型，組織形態的影響，為TLR9基因的相關研究提供實驗動物模型，為進一步探究TLR9在免疫性疾病、腫瘤發生發展中作用及機制奠定基礎。

1 材料

1.1 實驗動物采用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建TLR9基因敲除小鼠(C57BL/6J)，本工作委托新鄉醫學院梁銀明博士實驗室制備。野生型(wild type，WT)C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：[SCXK-(京)2012-0001]。嚴格按照SPF級動物飼養標準進行飼養，飼養過程實行自由采食和飲水，每周更換3次墊料并補充飼料和飲用水。飼養環境內的溫度控制在(20～25) ℃，濕度控制在40%～60%，通風良好，環境安靜，室內保持12 h明暗交替。所有實驗動物的操作及飼養均符合河南大學實驗動物管理與倫理委員會相關規定。

1.2 主要試劑與儀器TIANamp Genomic DNA Kit(天根生化科技公司)；RNA提取試劑(TRIzol)(美國Invitrogen公司)；Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒、TB GreenTMFast qPCR Mix反應試劑(日本TaKaRa公司)；免疫組化試劑盒(上海生工生物公司)；蛋白酶抑制劑Cocktail(羅氏公司)；RIPA裂解液(碧云天公司)。TLR9抗體(Abcom公司)；偶聯HRP抗鼠、抗兔二抗(Cell Signaling公司)；SLAN-96實時熒光定量PCR儀器(ZEESAN公司)，Qsep100全自動核酸分析儀(光鼎Bioptic公司)，C1000 Touch Thermal Cycler熱循環儀(BIO-RAD)，Nanodrop2000核酸定量儀(Thermo公司)。

Tab 1 DNA identification and RT-PCR primer sequences of mice

1.3 C57BL/6J小鼠TLR9基因敲除模型制備與處理繁殖初期，將TLR9基因敲除雄性小鼠與野生型雌性小鼠，1 ∶2進行合籠，小鼠的性成熟期為8周左右，母鼠妊娠期為21 d左右。待繁殖出F1代雜合型小鼠后，1∶2進行合籠，擴大繁殖得到更多F2代小鼠進行檢測。小鼠出生后第2周，打耳標，剪鼠尾，提取基因組DNA進行基因型鑒定，與母鼠分籠單獨飼養。1年內共繁殖6代，獲得F6代小鼠。每代交配與繁殖根據實驗所需的基因型及小鼠數量確定。小鼠出生后第2～12周內每周稱量體質量1次，并進行后續實驗。

1.4 引物的合成根據Gene ID小鼠基因組序列信息和打靶位點側翼序列信息(從美國國家生物技術信息中心數據庫網站https://www.ncbi.nlm.nih.gov下載)，采用Primer Premier5.0軟件設計小鼠DNA鑒定引物(TLR9-WT)及Real-time-PCR引物(TLR9-RT)序列，所有引物均由上海生工合成(Tab 1)。

2 方法

2.1 TLR9基因敲除小鼠基因型鑒定剪取約0.5-1 cm鼠尾組織放入1.5 mL無菌Ep管中，參照TIANamp Genomic DNA Kit說明書步驟提取基因組DNA。PCR反應體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL、DNTP 2 μL、Taq HS 0.1 μL、Forward Primer(2 μmol·L-1)2 μL、Reverse Primer(2 μmol·L-1)2 μL、DNA template 4 μL、ddH2O 4.8 μL。反應條件：94 ℃預變性，3 min；98 ℃變性，10 s；60 ℃退火，30 s；72 ℃后延伸，1 min；循環35次。利用毛細管凝膠電泳技術進行鑒定基因型。將PCR產物用Dilution Buffer進行10倍稀釋，通過Qsep100全自動核酸蛋白分析儀檢測小鼠基因型，采用較高靈敏度的S2(standard cartridge 2，S2)卡夾，S2卡夾為可替換的預制膠卡夾，無需制膠，灌膠，全自動進樣，每支卡夾可分析100～200個樣品。電泳過程中使用20 bp～5000 bp的Alignment Marker和Size Marker，分析系統自動輸出電泳峰圖和凝膠電泳圖。PCR產物送往上海生工生物公司測序。測序結果利用Chromas軟件進行分析對比確定TLR9基因敲除效果。

2.2 Real-time PCR檢測TLR9 mRNA的表達采用TRIzol法提取組織總RNA，根據Prime ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒的說明制備cDNA樣品。使用TB GreenTMFast qPCR Mix進行qRT-PCR實驗檢測組織中mRNA的表達。PCR反應體系(20 μL)：SYBR Fast qPCR Mix(2×) 10 μL、Forward Primer(10 μmol·L-1) 0.8 μL、Reverse Primer(10 μmol·L-1) 0.8 μL、cDNA template 2 μL、ddH2O 6.4 μL。反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；95 ℃，15 s;60 ℃，1 min，循環40次；15 ℃，2 min。實驗結果采用2-ΔΔCt法分析處理。

2.3 Western blot檢測TLR9蛋白的表達提取小鼠脾組織和肝組織的總蛋白，BCA定量試劑盒進行蛋白定量。采用10% SDS-PAGE進行電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(TLR9 1 ∶1 000，β-actin 1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜，次日用PBST洗滌3次，每次5 min，加入對應的山羊抗鼠IgG二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min。ECL法顯影處理。

2.4 組織HE染色及免疫組化檢測TLR9蛋白的表達分離小鼠新鮮的脾、肝組織，4%多聚甲醛固定后進行常規石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，觀察TLR9基因敲除小鼠組織結構的變化。60 ℃烤片、組織切片脫蠟水化，參照上海生工生物公司產品即用型免疫組化學試劑盒說明書，以TLR9抗體為一抗進行免疫組化染色。顯微鏡觀察拍照。

2.5 血常規檢測剪鼠尾采血，利用血細胞分析儀進行血常規檢測。此實驗由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。

3 結果

3.1 TLR9基因敲除小鼠基因型鑒定結果在TLR9基因第二個外顯子區域設計DNA片段長度為1079 bp的引物，可根據條帶長度及Qsep100全自動核酸蛋白分析系統自動輸出電泳峰圖分析小鼠基因型。基因分型鑒定結果顯示，野生型(TLR9+/+)小鼠的基因組DNA擴增片段長度為1073 bp，單峰；純合型TLR9敲除(TLR9-/-)小鼠擴增片段長度約為522 bp，單峰；而雜合型(TLR9+/-)小鼠則兩條帶都可得到并顯示為雙峰(Fig 1A)。通過對測序結果對比發現，與野生型小鼠比較，TLR9-/-小鼠外顯子部位約缺失550 bp堿基序列，表明在TLR9基因敲除小鼠中，TLR9基因敲除成功(Fig 1B)。

3.2 TLR9基因敲除小鼠在mRNA水平和蛋白質水平敲除效果的鑒定我們進一步應用qRT-PCR方法檢測TLR9 mRNA在脾和肝臟組織中的表達水平。由Fig 2A可見，TLR9基因敲除小鼠的脾、肝組織中TLR9 mRNA表達水平低于野生型小鼠(P<0.01)。Western blot和免疫組織化學技術結果表明，TLR9-/-小鼠脾、肝組織中的TLR9蛋白幾乎不表達，而野生型小鼠脾、肝組織中的TLR9表達水平較高(Fig 2B、2C)。綜上可知，我們已成功建立TLR9基因敲除小鼠。

Fig 1 Genotyping of TLR9 knockout miceA. Genotyping results; B. Sequencing analysis results

Fig 2 Identification of TLR9 gene knockout effect

3.3 遺傳性狀分析本課題組采用雄性TLR9基因敲除小鼠與雌性野生型小鼠交配獲得F1代。將獲得的F1代雜合型小鼠進行自交，成功繁育出更多純合型F2代基因敲除小鼠。并對所得子代113只小鼠的性別及基因型進行分析，結果顯示，雌、雄的比例為49 ∶64；各基因型分布情況，TLR9+/+小鼠27只(占0.24)，TLR9+/-小鼠56只(占0.495)，TLR9-/-小鼠30只(占0.265)，分離比例基本符合孟德爾遺傳定律的1 ∶2 ∶1，說明TLR9基因敲除后對小鼠繁殖能力無明顯影響(Fig 3)。

Fig 3 Effect of TLR9 gene knockout on hereditary traits in mice

3.4 體質量分析為了解TLR9敲除對小鼠生長的影響，我們進一步對小鼠的相對體質量進行跟蹤。結果顯示，從第9周齡開始，雄性野生型小鼠體質量略高于TLR9基因敲除雄性小鼠，但差異無統計學意義，TLR9-/-小鼠與TLR9+/+小鼠體質量增長趨勢一致。結果表明，TLR9基因的缺失并不影響小鼠的生長(Fig 4)。

Fig 4 Body weight analysis of TLR9 knockout mice

3.5 TLR9基因敲除小鼠HE染色結果將TLR9+/+與TLR9-/-小鼠(14周齡)的主要組織進行HE染色，觀察TLR9基因的缺失對小鼠組織病理形態學的影響。結果發現TLR9敲除小鼠主要臟器脾、肝組織結構清晰，與野生型小鼠一致，未出現明顯異常，說明TLR9基因的敲除并不影響各主要臟器的生長發育(Fig 5)。

3.6 TLR9基因敲除小鼠血常規檢測取14周齡左右TLR9+/+和TLR9-/-小鼠外周血進行血常規檢測。檢測結果發現，TLR9基因敲除小鼠外周血淋巴細胞含量顯著少于野生型小鼠(P<0.05)，TLR9基因的敲除對小鼠外周血紅細胞、白細胞及血小板等組成及相關參數均無明顯影響(Tab 2)。

Fig 5 HE staining results of mouse tissues(×40)

Tab 2 Blood routine analysis of TLR9+/+and

IndexTLR9+/+TLR9-/-WBC(109/L)13.8±5.9211±4.08Lymph(109/L)11.17±5.398±3.24?Mon(109/L)0.09±0.300.06±0.24Gran(109/L)2.09±0.831.84±0.80Lymph%(%)79.58±7.0673.8±13.68Mon%(%)2.55±0.522.65±0.70Gran%(%)16.36±5.1218.35±5.45RBC(1012/L)7.92±1.378.62±1.02HGB(g/L)120.42±21.94131.71±17.16HCT(%)36.75±7.0339.67±4.85MCV(f/L)46.17±2.1245.9±2.21MCH(pg)15.08±0.7915.24±0.43MCHC(g/L)328.30±10.90327.90±14.68RDW(%)15.90±1.8515.10±1.19PLT(109/L)801.00±439.347784.50±244.42MPV(f/L)5.17±0.575.33±0.73PDW16.08±0.2816.14±0.35PCT(%)0.45±0.520.19±0.40

WBC：white blood cell；Lymph：lymphocyte；Mon：monocyte； Gran：granulocyte；Lymph%：percentage of lymphocytes；Mon%：percentage of monocytes；Gran%：percentage of granulocytes；RBC：red blood cell；HGB：hemoglobin；HCT：hematocrit；MCV：mean corpuscular volume；MCH：mean red blood cell hemoglobin content；MCHC：mean corpuscular hemoglobin concentration； RDW：red blood cell distribution width；PLT：platelet count；MPV：mean platelet volume； PDW：platelet distribution width；PCT：plateletcrit.*P<0.05vsTLR9+/+group

4 討論

TLR9是激活天然免疫應答的重要受體，也是連接天然免疫和獲得性免疫的重要橋梁，在機體免疫反應中均發揮重要作用。Song等[8]研究發現，TLR9在小鼠支氣管的炎癥反應發生過程中發揮重要作用，TLR9抑制劑能夠顯著減少煙霧環境(environmental tobacco smoke，EST)誘導的支氣管纖維化。Suresh[9]等構建TLR9-/-小鼠模型，并發現TLR9敲除可明顯抑制促炎性細胞因子和巨噬細胞趨化蛋白5(MCP-5)的釋放，減少肺泡巨噬細胞及中性粒細胞的募集和浸潤，最終影響了閉合性肺挫傷的發生。此外，TLR9參與腫瘤的發生發展，在許多腫瘤細胞系和腫瘤中表達上調，與腫瘤發生進展密切相關。研究表明，TLR9異常表達可誘導長期慢性炎癥反應，并進一步促進惡性轉變，導致腫瘤發生。在乳腺癌和卵巢癌中TLR9/NF-кB炎癥信號通路異常活化，且TLR9的表達水平與腫瘤的惡性程度呈正相關[10]。隨著TLR9在不同階段結腸癌組織中差異表達，其下游分子NF-κB蛋白在結腸癌組織中表達增加，并且在直腸癌組織中減少，TLR9信號激活參與結直腸癌的臨床過程并影響NF-κB的表達，促進炎癥因子的分泌形成炎性環境，加速結腸癌的發生發展[11]。Zhang等[12]發現，食管鱗狀細胞癌中TLR9的表達顯著高于正常組織，并與腫瘤的大小及病理分化程度呈正相關。另外，TLR9信號通路的激活在腫瘤侵襲、轉移等過程中也起著重要的作用。利用siRNA技術沉默前列腺癌PC3細胞中TLR9表達，可明顯抑制前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力[13]。Rath等[14]在體外研究中發現，利用TLR9激動劑處理結直腸癌株LS174和SW620后，腫瘤侵襲遷移相關的金屬蛋白激酶MMP13表達量增加，并且MMP13在結直腸癌中的顯著表達與較差存活率和遠處轉移存在相關，提示TLR9的激活可能促進結直腸癌細胞的轉移。上述這些研究結果均表明，TLR9在機體炎癥反應中發揮作用；其表達異常可能會導致機體免疫失衡，并促進腫瘤的生長、侵襲和遷移，加快腫瘤的發展。

基因敲除小鼠是構建人類遺傳疾病模型和藥物篩選的重要模式動物，可在短時間內模擬疾病的發生和發展，在疾病發生機制研究及藥物篩選中具有重要的應用價值[15]。構建TLR9基因敲除小鼠對于進一步研究其在免疫調節、炎癥發生及腫瘤進展中的作用具有重要意義。目前，應用CRISPR/Cas9系統來構建基因敲除小鼠模型是廣泛認可的實驗手段。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術構建TLR9基因敲除小鼠模型，并在DNA、mRNA及蛋白多個水平對敲除效果進行驗證，確認成功構建TLR9基因敲除小鼠。通過觀察TLR9基因敲除小鼠生長繁殖情況，發現TLR9基因敲除小鼠與野生型小鼠一樣具有正常的生長繁殖能力，子代生長狀況良好，并且TLR9基因敲除對小鼠脾、肝組織這些重要臟器的結構沒有明顯影響。綜上所述，本研究成功建立了TLR9基因敲除小鼠模型，為詳細闡明TLR9基因的生物學功能奠定基礎，為探究TLR9在免疫、炎癥相關性疾病和腫瘤發病機制中的作用提供實驗動物模型。