基于cAMP/PKA通路研究當歸芍藥散提取液對阿霉素誘導IMCD3細胞損傷的保護作用

歐美鳳，劉浩坤，楊 沫，王運來，許 釩

(安徽中醫藥大學藥學院，中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)臨床表現為大量蛋白尿(成人尿蛋白排出量>3.5 g·d-1)、高度水腫、低蛋白血癥(血漿白蛋白<30 g·L-1)以及高脂血癥，水腫是其特征表現[1]。目前主要通過激素給藥治療，通過抑制機體免疫炎癥反應來改變腎小球基底膜通透性而發揮利尿作用。雖取得一定療效，但許多患者產生了不同程度的耐受，或因不良反應嚴重被迫停藥，最終發展到晚期腎衰[2]。因此，深入研究中藥防治NS的機制，開發安全有效的治療藥物具有重要的社會意義及經濟意義。阿霉素(adramycin，ADR)是臨床常用的抗惡性腫瘤藥物，然而，ADR也具有廣泛的細胞毒性[3]。ADR可使膜結構發生變化，而此變化經常會造成腎小球濾過膜產生膜電位異常，腎小球濾過屏障缺損，最終導致腎小球濾過膜通透性改變，腎小管對水液重吸收異常，引起細胞損傷死亡。內髓集合管細胞(inner medullary collecting duct cell，IMCD)是哺乳動物腎小管的最后一段，連續傳代幾乎沒有表型，保持了IMCD特殊的功能性，對水和酸堿平衡穩態的維持具有重要作用，因此廣泛應用于水液平衡等研究領域。

水通道蛋白-2 (aquaporin 2，AQP2)是調節體內水穩態的重要蛋白質，也是腎臟集合管水代謝調節的主要蛋白，存在于細胞頂端質膜及細胞內小泡，細胞頂端質膜的AQP2含量決定著集合管細胞的通透性，在水的重吸收和排泄方面起到重要的調節作用[4-5]。環磷酸腺苷(cyclc-AMP，cAMP)-蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)-cAMP反應元件結合蛋白(cAMP-responsive element binding protein，CREB)通路是細胞內水液平衡信號轉導的主要途徑，水通道蛋白家族中大都含有PKA磷酸化的同源序列，并且受到磷酸化作用的直接調節，它們的異常表達與cAMP-PKA信號通路的激活具有重要關聯。課題組前期在進行當歸芍藥散(Danggui-Shaoyao-San，DSS)對大鼠慢性應激抑郁模型、肝硬化腹水模型以及NS模型的實驗研究，發現DSS對AQP2有明顯的調控作用[6-8]。因此，本研究從細胞水平出發，觀察ADR對IMCD3細胞增殖的影響，研究DSS提取液對IMCD3細胞AQP2的作用，并進一步探討DSS提取液是否可通過提高Na+，K+-ATP酶活性，調節cAMP-PKA-CREB通路，達到對IMCD3細胞的保護。

1 材料與方法

1.1 細胞株IMCD3細胞，購自上海賽齊生物科技有限公司。

1.2 藥液制備DSS處方藥材，購自安徽普仁中藥飲片有限公司，并經安徽中醫藥大學金傳山教授鑒定，均符合2015版《中國藥典》。按處方比例(當歸 ∶芍藥 ∶川芎 ∶白術 ∶茯苓 ∶澤瀉=3 ∶16 ∶8 ∶4 ∶4 ∶8)稱取藥材，加入10倍量的75%乙醇回流提取1.5 h，收集濾液；殘渣再加8倍量75%乙醇回流提取1.5 h，合并兩次濾液，使用旋轉蒸發儀濃縮。制備生藥濃度為1.72 kg·L-1的DSS藥液。取DSS提取液12 000 r·min-1離心15 min，轉移至事先滅菌好的超凈工作臺，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，分裝于10 mL離心管中，-20 ℃保存備用。

1.3 試劑ADR(注射用鹽酸多柔比星，浙江海正藥業股份，批號：19002011)；H-89(美國MCE公司，批號：HY-15979)；胎牛血清(德國Serana公司，批號：S-FBS-SA-015)；胰酶消化液(碧云天生物技術研究所，批號：C0201)；高糖DMEM培養基(美國HyClone公司，批號：AC10254368)；MTT(美國Amersco公司，批號：CT0025)；二甲亞砜(DMSO，德國Sigma公司，批號：D5879)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司，批號00287813)； Na+,K+-ATP酶檢測試劑盒(美國Cell Signaling公司，批號：3010)；cAMP檢測試劑盒(武漢Elabscience公司，批號：E-EL-0056c)；抗體AQP2(美國Cell Signaling公司，批號：3487S)、PKA(美國Cell Signaling公司，批號：5842)、CREB(美國Cell Signaling公司，批號：9197T)。

1.4 儀器細胞培養箱(日本Sanyo公司)；多功能酶標儀(美國MD公司)； Mx3000P實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀(Agilent公司)；EPS300電泳儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養將IMCD3細胞置于5% CO2細胞培養箱中37 ℃培養，每2 d更換1次培養基，當生長至80%時，用胰蛋白酶消化液消化收集細胞，以1 ∶2傳代培養。

2.2 MTT法測定IMCD3細胞增殖情況取對數生長期、生長良好的IMCD3細胞種板，每孔加入含濃度為1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11mol·L-1ADR的無糖培養基和空白培養基150 μL，培養24 h后，加入MTT稀釋液，酶聯免疫檢測儀檢測各孔的吸光值，篩選出最適ADR濃度。后將實驗分為空白組、模型組、DSS提取液組(濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L-1)。細胞生長至對數期后，按照細胞密度為2×107·L-1接種于96孔培養板內培養，檢測各孔吸光度值，并篩選出合適的DSS提取液濃度。

2.3 Western blot檢測ADR誘導IMCD3細胞蛋白表達接種密度為1×108·L-1的IMCD3細胞，加入DMEM高糖培養基(含10% FBS)3 mL，培養24 h貼壁后，棄完全培養基，加入上述不同濃度的ADR溶液300 μL。待藥物作用24 h后，加入裂解液約400 μL，于4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉移至另一支預冷的EP管中，BCA法測定蛋白含量后，將剩余蛋白樣品按照1 ∶4的比例加入5×SDS上樣緩沖液。SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜。用配制的封閉液37 ℃封閉2 h后，加一抗(1 ∶1 000)，4 ℃過夜。洗膜，并加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育2 h。化學發光、顯影、定影，Bio-Rad凝膠圖像處理系統分析，計算灰度值，測定AQP2蛋白表達。另將細胞分為空白組、模型組、DSS提取液低、中、高劑量組(0.8、1.6、3.2 g·L-1)和H-89抑制劑組。待藥物作用24 h后，按上述步驟檢測PKA、CREB、AQP2蛋白表達。

2.4 ELISA法檢測細胞cAMP水平變化實驗分為空白組、模型組、DSS提取液低、中、高劑量組、H-89抑制劑組。將細胞接種于6孔板中，并加入新鮮的完全培養基。24 h后觀察細胞狀態。待IMCD3細胞長至80%左右時，倒掉完全培養基，加入不含血清的高糖DMEM培養24 h，在細胞同步化后，按上述組加入不同藥物干預，收集各組細胞的上清液，3 000 r·min-1離心15 min，取上清并標記，-20 ℃分裝保存備用。根據cAMP試劑盒使用說明書測定IMCD3細胞上清液cAMP含量。

2.5 細胞Na+，K+-ATP酶活性檢測實驗分為6組，分別為空白組、模型組、DSS提取液低、中、高劑量組、H-89抑制劑組。24 h后，將IMCD3細胞消化后，加入10 mL離心管離心，棄上清液，留下細胞沉淀，每管細胞加入300 μL生理鹽水重懸細胞，采用超聲粉碎器對細胞進行粉碎，粉碎后，采用BCA試劑盒檢測離心管內蛋白含量，再將細胞勻漿液稀釋成不同濃度進行預試，根據預試結果決定取樣濃度(預試結果將絕對吸光度值控制在0.2左右)。根據Na+,K+-ATP酶試劑盒酶促反應步驟，測定IMCD3細胞Na+,K+-ATP酶活性。

2.6 Real-time PCR檢測細胞PKA、CREB、AQP2 mRNA表達實驗分為空白組、模型組、DSS提取液低、中、高劑量組、H-89抑制劑組。使用TRIzol總RNA提取試劑分別提取IMCD3細胞中總RNA，在紫外檢測儀上檢測所提取RNA樣品的260 nm和280 nm處吸光度A，根據其值確定RNA的純度和濃度，A260/A280>1.8，逆轉錄得到cDNA后擴增目的基因。逆轉錄反應操作按照試劑盒說明進行，以β-actin為內參，基因引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

3 結果

3.1 ADR對IMCD3細胞增殖的影響ADR濃度在1×10-7mol·L-1以上，細胞基本死亡，可見對細胞呈不同程度的抑制(P<0.01)；當其濃度降低為1×10-9、1×10-10、1×10-11mol·L-1時，OD值增高，對細胞生長呈現不同程度的促進(P<0.01)。見Fig 1。

Fig 1 Effect of different concentrations of ADR on cell

*P<0.05,**P<0.01 vs control

3.2 ADR誘導IMCD3細胞AQP2表達如Fig 2所示，ADR濃度為1×10-8mol·L-1時，可明顯下調AQP2蛋白表達；濃度為1×10-10、1×10-11mol·L-1時，AQP2蛋白表達均有不同程度的升高，差異具有顯著性(P<0.01)。

Fig 2 Effect of different concentrations of ADR on AQP2 protein

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.3 DSS提取液對損傷的IMCD3細胞生長增殖的影響如Fig 3所示，與正常組相比，模型組OD值明顯降低；DSS提取液(0.2、0.4、0.6、0.8 g·L-1)作用后，對ADR損傷的IMCD3細胞生長增殖無明顯影響，DSS提取液(1.6、3.2 g·L-1)對ADR損傷的IMCD3細胞生長增殖具有明顯的促進作用(P<0.05)，而6.4 g·L-1以上濃度則對IMCD3細胞生長增殖具有不同程度的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

Fig 3 Effect of DSS extract on IMCD3 cells viability

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.4 DSS提取液對ADR誘導的IMCD3細胞cAMP水平的影響如Fig 4所示，與正常組相比，模型組cAMP含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，DSS提取液各劑量組cAMP含量均有不同程度的提高，其中中劑量最為明顯，H-89抑制劑組較模型組比較無明顯變化。

Fig 4 Effect of DSS extract on cAMP content

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

3.5 DSS提取液對ADR誘導的IMCD3細胞Na+,K+-ATP酶活性的影響如Fig 5所示，與正常組比較，模型組Na+,K+-ATP酶活性明顯降低(P<0.01)；較模型組比，DSS提取液高、中、低劑量組均能提高Na+,K+-ATP酶活性，且中劑量對Na+,K+-ATP酶活性的提高最為明顯(P<0.01)。

Fig 5 Effect of DSS extract on ADR-induced Na+，K+-ATPase

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.6 IMCD3細胞PKA、CREB、AQP2 mRNA表達如Fig 6所示，與正常組相比，模型組細胞PKA、CREB、AQP2 mRNA表達均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，當DSS提取液中、高劑量組均可上調PKA、CREB、AQP2 mRNA表達水平(P<0.01)，但低劑量組上調AQP2 mRNA不明顯。

Fig 6 Effect of DSS extract on ADR-induced PKA, CREB, AQP2 mRNA expression in IMCD3

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.7 IMCD3細胞PKA、CREB、AQP2蛋白表達如Fig 7所示，與正常組相比，模型組細胞PKA、CREB、AQP2蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)；DSS提取液作用后，中、高劑量組均能明顯上調PKA、CREB、AQP2蛋白表達(P<0.05，P<0.01)，而低劑量組PKA、CREB、AQP2蛋白表達無明顯增加。H-89抑制劑組可明顯下調IMCD3細胞PKA、CREB、AQP2蛋白的表達。

Fig 7 Effect of DSS extract on ADR-induced PKA, CREB and AQP2 protein expression in IMCD3

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

4 討論

NS總屬本虛標實，患者多水腫嚴重，常伴有瘀血。DSS作為中醫經典活血利水方劑，最早記載于東漢張仲景所著的《金匱要略》，是由當歸、芍藥、川芎、茯苓、白術、澤瀉六味藥組成，養血斂陰、活血行血，健脾化濕、燥濕利水。六藥合用治療NS，則標本兼顧，共奏活血利水之功效。現代藥理學研究發現，DSS具有抗抑郁，抗炎，抗血小板聚集和抗氧化等作用[9]。近年來越來越多的研究表明，單萜糖苷類、苯酞類、三萜類等是DSS的典型成分。該方中當歸、芍藥、川芎主要成分為當歸多糖、白芍總苷、阿魏酸及川芎嗪可增加腎血流量，改善腎小球系膜細胞增殖，對腎臟具有一定的保護作用[10-11]；而白術、茯苓、澤瀉的主要成分為白術內酯Ⅰ、茯苓多糖、澤瀉醇等能夠促進水鈉排泄，增加血清白蛋白，降低總膽固醇和甘油三酯的含量，減輕NS時水鈉潴留及高脂血癥。

Na+,K+-ATP酶是一種鑲嵌在細胞膜中的蛋白質，其通過膜內和膜外的膜電位差及細胞膜滲透壓，依賴ATP水解供能，改變膜內外Na+及K+含量。研究發現，在各種腎臟疾病中Na+,K+-ATP酶功能有所下降[12]。cAMP是由ATP發生縮合反應脫掉自身兩個磷酸形成的，當機體受到外界刺激后，體內激素刺激細胞促使細胞生成cAMP，進而參與細胞內不同的生理活動及能量代謝轉換。PKA由兩個調節亞基(R)和兩個催化亞基(C)組成，在特定條件刺激下R亞基可與機體的cAMP特異性結合，參與體內水液平衡的調節。CRE是一段由約30 bp的DNA片段構成的cAMP應答序列，該原件的激活對水液平衡的調節有著至關重要的影響。

本實驗采用濃度為1×10-8mol·L-1的ADR進行IMCD3細胞損傷后，以Na+,K+-ATP酶活性、PKA、CREB和AQP2為DSS提取液的調控對象。實驗結果顯示，當給予DSS提取液作用后，IMCD3細胞中Na+,K+-ATP酶活性明顯增強，同時cAMP合成增加且PKA、CREB、AQP2蛋白表達上調。提示DSS提取液可通過激活cAMP-PKA-CREB信號通路，同時也可激活通路上游Na+,K+-ATP酶，直接或間接調控AQP2分子，實現對ADR誘導的IMCD3細胞保護作用，維持細胞水液平衡。其中，H-89作為PKA抑制劑，該組與模型組Na+,K+-ATP酶活性存在明顯差異，推測可能由于Na+,K+-ATP酶的短時調節作用，導致結果差異較大。本研究從分子水平探究了DSS提取液對ADR誘導損傷的IMCD3細胞調控的信號通路，為DSS提取液對IMCD3細胞水液平衡調節的挖掘提出了可能的作用靶點，更為DSS治療NS的臨床合理應用提供了又一有效依據。