基于實時細胞分析技術的烏頭堿致心律失常體外評價技術研究

尤欣宇，馬 靜, 尹清晟，王 曼，張艷軍，莊朋偉

(天津市中藥藥理學重點實驗室，天津中醫藥大學，天津 301617)

心律失常是臨床常見疾病，極大影響患者的生活質量和生命安全。因此抗心律失常藥物的研發是目前醫療事業重要的任務之一[1]。合適的抗心律失常模型是藥物研發的重要前提，整體動物的心律失常模型，與臨床疾病發生、發展的相似性較高且重復性較好，但其傳統的檢測手段多存在技術要求高、勞動太過密集等不足。體外心律失常模型已被較多研究者重視，建立新型、準確的體外心律失常檢測手段對于抗心律失常藥物的研發已亟不可待。實時細胞分析RTCA Cardio系統能對細胞狀態進行實時、準確、敏感的監測，觀察心肌搏動頻率、幅度和波動節律不規則性等指標的變化[2]。心肌細胞具有自發性節律性離子交換、同步搏動等特點，且排除了機體神經、體液等各種復雜因素的干擾，是離體心律失常模型較為理想的選擇[3]。烏頭堿可導致室性快速性心律失常[4]。因此，本實驗以烏頭堿為工具藥，結合整體動物實驗，利用RTCA Cardio技術檢測烏頭堿對心肌細胞的影響，建立體外心律失常評價技術，為抗心律失常藥物的評價及研發提供方法學依據。

1 材料

1.1 實驗動物♂ SD大鼠，體質量(200±20 g)，由北京華阜康實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(京)2009-0004；天津中醫藥大學實驗動物中心飼養；1～2 d SD大鼠：中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所實驗動物中心，許可證號：scxk(軍)2009-003。

1.2 主要試劑及材料烏頭堿：成都曼思特生物科技有限公司生產，批號MUST-13012802；胎牛血清：Gibco公司，批號1227693。DMEM高糖培養基：Hyclone公司，批號NYL1023；胰蛋白酶：Gibco公司，批號1371058；二型膠原酶：Gibco公司，批號1102392；DMSO：北京索萊寶科技有限公司，批號8023271。

1.3 實驗儀器八導生理記錄儀(MP-100，美國BIOPAC)；酶標儀(Multiskan Ascent, Thermo Labsystems, 美國)；CO2恒溫培養箱(Thermo Scientific Cytoperm公司)；倒置相差顯微鏡(德國XD-101 98010)；96孔電極板(美國羅氏公司產品)；Milli-Q純水系統(Millipore)；實時無標記心肌細胞分析系統(RTCA Cardio美國羅氏公司)。

2 方法

2.1 在體動物實驗觀察烏頭堿誘發心律失常實驗選取♂ SD大鼠體重(200±20) g，質量分數20%的烏拉坦0.06 mL·kg-1麻醉，仰位固定，針形電極，插入四肢皮下，連續記錄標準肢體Ⅱ導聯ECG。待心電圖穩定5 min后，快速(10 s內)舌下靜脈注射烏頭堿50 mg·g-1[5]，隨后記錄1 h心電圖、統計心率、RR間期及心律失常類型。

2.2 RTCA Cardio系統E-Plate Cardio 96 細胞接種密度的篩選取新生1～2 d的大鼠乳鼠，無菌操作取出心臟心尖部，放入預冷的DMEM中，沖洗后剪去血管和心房組織，DMEM漂洗3次，將心尖轉移到D-Hank’s中，用眼科剪剪成約1 mm3的小塊，加入消化酶溶液(質量分數0.07% 的Trypsin 和質量分數0.05% 的Collagenase Type II in D-Hanks) 37 ℃水浴震蕩消化20 min，收集上清液過200目細胞篩，收集細胞懸液，800 r·min-1離心5 min，用DMEM培養基(添加10% FBS、10萬 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素，pH7.2)重懸細胞，將細胞懸液收集到培養瓶中進行差速貼壁2次，每次60 min，將差速貼壁后的心肌細胞懸液接種于質量分數0.1%的明膠溶液包被E-Plate Cardio 96板中培養。心肌細胞濃度梯度初步設為5.00×103、2.00×104及1.00×105個/孔，實時記錄72 h后，脫機分析不同原代心肌細胞濃度梯度CI值的均值和偏差選擇最佳心肌細胞接種密度。

2.3 基于RTCA Cardio系統評價烏頭堿誘發心律失常原代培養心肌細胞按2.00×104個/孔的細胞數接種，當搏動穩定后開始加藥，烏頭堿濃度梯度為0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、4 μmol·L-1、8 μmol·L-1。設置儀器監測步驟為：Step 1,每隔1 min監測一次，循環10次；Step 2,每隔1 h監測一次，循環48次；Step 3, 每隔15 min監測一次，循環8次；Step 4, 每隔1 min監測一次，循環10次(加藥前)；Step 5, 每隔1 min監測一次，循環60次(加藥后)；Step 6, 每隔5 min監測一次，循環12次；Step 7, 每隔15 min監測一次，循環100次。接種24 h后，將預先溫育的細胞培養基(10% FBS DMEM)，沿孔壁在每孔中加入150 μL培養基；d 3加藥前換液185 μL/孔，在儀器上平衡2 h后加藥，繼續監測。監測結束后，脫機使用RTCA Cardio系統自帶數據分析模塊，分析細胞搏動情況、CI值曲線、Normalized beating rate(搏動頻率)、Normalized amplitude(搏動幅度)以及Beating Rhythm Irregularity(節律不規則性)。

3 結果

3.1 烏頭堿誘發實驗大鼠心律失常的實驗結果造模前心電圖為正常竇性心律，舌下靜脈注射烏頭堿1 min后，發生明顯的室性心律失常。注射烏頭堿后5 min，尤其以出現較嚴重的非持續性室性心動過速(VT n)，待注射烏頭堿后8 min時，出現持續性室速，有的甚至發生室顫(Fig 1A)。當靜脈注射烏頭堿10 min后，RR間期明顯縮短(Fig 1B)；15 min后，觀察到心率顯著上升，這種狀態能維持10～15 min(Fig 1C)。靜脈注射烏頭堿后出現室性心律失常。按順序發生的心律失常類型依次是VPB、VS、VTn、VB、NS-VT、SVT(Fig 2)。

3.2 RTCA Cardio系統E-Plate Cardio 96細胞接種密度的篩選如Fig 3所示，RTCA Cardio系統監測細胞接種密度，若接種密度偏小，CI值過小，則不能形成細胞搏動同步化；若接種密度過大，CI值以先緩慢增長，隨后很快下降的趨勢(由于細胞接種過多，前期細胞有增長，但很慢，后期細胞鋪滿孔底，生長狀態不佳，CI值逐漸下降)因此，通過 E-Plate Cardio 96 的最佳接種密度篩選，以2.00×104個/孔接種最優。

3.3 基于RTCA Cardio系統評價烏頭堿對心肌細胞搏動的影響通過RTCA Cardio 系統E-Plate Cardio 96 細胞接種密度的篩選，選用2.00×104個/孔接種到96孔電極板中，培養。當搏動穩定后開始加藥，烏頭堿濃度梯度為0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、4 μmol·L-1、8 μmol·L-1，RTCA Cardio系統監測結果如Fig 4-1、4-2所示，烏頭堿不同濃度對心肌細胞CI值的影響，呈一定的量效關系，隨劑量的增加，其對原代心肌細胞的抑制作用增強(如Fig 4-1)；不同濃度烏頭堿(Aco)均能明顯增加心肌細胞的搏動頻率、抑制心肌細胞的搏動幅度、增加心肌細胞不規則搏動以及引起細胞搏動波形的異常(Fig 4-2)，且均呈一定的量效關系。提示RTCA Cardio 系統可以檢測烏頭堿誘導的心肌細胞心律失常現象。

Fig 1 ECG, RR interval and heart rate results of arrhythmia induced by aconitine

A: ECG of arrhythmia induced by aconitine; B: Effect of aconitine on RR interval; C: Effect of aconitine on heart rate,n=8

Fig 2 Six types of arrhythmias induced by aconitine

VS, ventricular ejection; VPB, ventricular premature beat; VB, ventricular binary rhythm; VTn, paroxysmal ventricular tachycardia; NS-VT, non-persistent ventricular tachycardia; SVT, persistent ventricular tachycardia

Fig 3 Screening suitable cell inoculation density by RTCA Cardio system: CI value curve of different density primary cardiac myocytes

Fig 4-1 Effect of Aco on CI value of cardiac myocytesby RTCA Cardio system

4 討論

心律失常是臨床上心血管疾病中最常見的一種疾病，其發病率和病死率均較高，大約占自然死亡人數的11%，嚴重影響人類健康[6]。所以尋求一個從根本上辨析和評價心律失常疾病的途徑極為重要。建立適當的模型，不僅能為該疾病的發病機制和病理生理改變的研究奠定基礎，而且能推進臨床診斷和各種治療方法的進步。由于心律失常的本質是心臟激動的起源或傳導異常所致的心律或心率改變，傳統上使用膜片鉗技術雖然也可以通過場點位的結果來檢測動態信號改變，但是它是勞動密集型技術，要求技術高，得出的結論卻很少[7-8]。實時細胞電子分析技術RTCA是一種建立在阻抗基礎上的瞬時細胞電感應連續記錄系統，是藥物臨床前早期篩選的一個重要工具，能將心肌細胞對引起心律失常的藥物的響應用特征性的搏動圖譜呈現，進而檢測時間分辨率。同時，通過動態監測保證了心肌細胞瞬時響應及長時效應的獲取。Filomain等[9]采用xCELLigenCeRTCACardio系統監測iPS-CM，發現具有潛在致心律失常的藥物。李光等[10]基于RTCA 技術監控H/R(缺氧/復氧)條件對 H9c2心肌細胞的損傷作用，為心肌缺血再灌注損傷模型嚴格把控。趙琪等[11]基于人胚胎干細實時細胞分析技術對HESC-CM 進行長時間實時動態監測，準確預測了非離子通道藥物潛在的心臟毒性。

Fig 4-2 Effects of Aco on normal cardiac myocytesanalyzed by RTCA Cardio system

A: The effect of Aco on normalized beating rate, normalized amplitude and beating rhythm irregularity of cardiac myocytes; B:Aco on beating state of cardiac myocytes.**P<0.01vsnormal group

現代研究發現，烏頭堿可引起心律失常表現，其機制目前認為與激活并使心肌細胞的鈉通道開放，加速了心肌細胞中的鈉離子內流，促使細胞膜去極化，加速起搏點的自律性，或者誘發異位節律點，縮短心肌不應期有關[12]。且心肌細胞屬于末端分化細胞，由于其無分裂增殖能力的特點，很難構建穩定、具有心肌細胞功能的細胞系，因此一般使用原代培養的方法[13]。體外培養的心肌細跑，具有心肌細胞結構和功能上的某些特點，如自發性節律性離子交換、同步搏動等，并且排除了機體神經、體液等各種復雜因素干擾[14]。劉義等[15]應用培養心肌細胞的慢反應心肌細胞的電生理特性,作為防治心律失常藥物研究的模型。

本實驗先在整體動物水平上驗證烏頭堿具有引發心律失常的作用，然后在體外細胞水平上利用RTCA Cardio系統評價烏頭堿對心肌細胞造成的心律失常現象，發現烏頭堿對心肌細胞的作用呈一定的量效關系，隨著劑量的增加，其對原代心肌細胞的抑制作用增強，當濃度8 μmol·L-1時，效果最明顯，且能增加心肌細胞的搏動頻率、抑制心肌細胞的搏動幅度、增加心肌細胞不規則搏動，以及引起細胞搏動波形的異常。證實了RTCA Cardio系統可以建立實驗全過程的實時細胞質量控制，可以檢測到各種微小或者顯著性的細胞CI值和搏動情況的變化，是一項成熟穩定的體外心律失常評價技術，為抗心律失常藥物的研發提供了方法學參考。

(致謝:本實驗在天津中醫藥大學，天津市中藥藥理學重點實驗室完成。)