富血小板血漿對MRSA的體外抑菌實驗研究

劉泉體 高海明 蘭 婷 吳佳奇

西南醫科大學附屬中醫醫院創傷外科，四川省瀘州市 646000

富血小板血漿是血液經過離心、分離而得到的血小板高度濃縮的血液制品，通常認為其血小板含量為正常全血的5倍以上[1]。而富血小板凝膠是富血小板血漿中血小板激活的產物，通常由凝血酶、鈣離子介導激活。由于其富含多種生長因子，臨床上將其應用于創面及軟組織的修復[2]。近年來，隨著人們對其研究的深入，發現PRP有著一定的抗菌效應，涉及到的細菌包括甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌[3]、糞腸球菌[4]等。近年來甚至有學者表示其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)也有抗菌效應[5-6]。由于MRSA作為多重耐藥細菌，其高致病性及高毒力，使得其造成的傷口感染易遷移不愈及反復發作，治療困難。而關于PRP抗菌效應的研究受限于多種因素，其抗菌譜目前尚無統一結論，為此，本研究將通過體外實驗觀察健康志愿者全血提取的PRP及其激活產物PRG對MRSA是否有抗菌效應，為PRP的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 MRSA臨床菌株由西南醫科大學病原微生物實驗室提供(來源于1例慢性骨髓炎患者)。

1.2 材料及設備 一次性真空采血管(10ml、2ml，藍管)、采血針、一次性注射器(江蘇宇力醫療)、全自動血細胞分析儀(希森美康)、葡萄糖酸鈣注射液(四川美大康華康)、凝血酶凍干粉(湖南一格)、營養肉湯培養基、MH瓊脂培養基、哥倫比亞血瓊脂平板(杭州微生物)、分光光度儀、比色皿(上海元析)、電子天平(梅特勒—托利多)、一次性培養皿(90mm)、牛津杯(上海兢翀)、硫酸慶大霉素注射液(西南藥業)、立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療)，隔水式恒溫培養箱(上海齊欣)、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海齊欣)、低速離心機(中佳 SC-2546)、氣浴恒溫振蕩器(金壇市瑞華儀器)、生物安全柜(海爾)等。

1.3 菌株的活化、增菌 將凍存的MRSA臨床菌株取1接種環劃線法接種至血瓊脂平板，37℃恒溫培養箱培養24h。配置100ml營養肉湯培養基，高溫蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min。取2支15ml離心管，各加入10ml已冷卻的上述營養肉湯，將血培養皿上形態規則的菌落1接種環接種至其中1支離心管，2只離心管均放入搖床，150rpm，37℃，16h后取出。

1.4 PRP的制備 采集6名健康志愿者(3男，3女，平均年齡26歲)，志愿者無心腦血管等基礎疾病，實驗前3個月內無感染性疾患、未服用過抗生素、抗凝藥物或免疫抑制藥物。一次性10ml、2ml真空采血管采集每名志愿者肘部靜脈血，2ml采血管直接血細胞分析儀計數血小板，10ml采血管使用低速離心機以300×g離心力(1 410rpm)，離心10min，以注射器抽取全部上層血清至紅細胞層下約3mm轉移至另一真空離心管(不含任何藥物)，再次以700×g離心力(2 150rpm),離心10min，抽取約3/4上層血清，余下約1ml，反復搖勻即為PRP，取200μl血細胞分析儀計數血小板。余下PRP于3h內進行實驗。

1.5 慶大霉素溶液、葡萄糖酸鈣—凝血酶溶液制備 取硫酸慶大霉素注射液(40 000U/ml)用滅菌純水梯度稀釋法稀釋至40U/ml備用。取10%葡萄糖酸鈣注射液2ml加入200U凝血酶凍干粉中，臨用前配置。

1.6 打孔法抑菌實驗 配置MH瓊脂培養基270ml，分裝至3瓶100ml容量瓶中，每瓶裝90ml，高溫蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20min，放置于室溫下逐漸冷卻。將增菌完畢的菌懸液在搖菌16h取出，以增菌用營養肉湯為對照，分光光度計測定原菌液OD600值，通過營養肉湯倍比稀釋至OD值為0.5左右。取稀釋后的該菌懸液以滅菌純水梯度稀釋100倍，取10ml分別倒入冷卻至45℃左右的MH瓊脂培養基中搖勻，再另取該菌懸液1ml以滅菌純水梯度稀釋法稀釋至10-6、10-7、10-8數量級，各取100μl于營養瓊脂培養基中涂板計數，每個數量級涂板2個，取平均數。取20個一次性培養皿，每個培養皿均分為A、B、C、D四個區域，每個區域即為一組，區域中心放置牛津杯(內徑為6mm，外徑為8mm)，將配置好的帶菌液的培養基每15ml傾注至一次性培養皿中制備帶菌平板共20個。放置5min后取出牛津杯，此時MH瓊脂培養基已凝固，四個區域中心各1個直徑約8mm孔，分別于上述ABCD四個區域各孔中加入50μl硫酸慶大霉素溶液、PRP、PRP、滅菌純水。于C區域中加入5μl葡萄糖酸鈣—凝血酶溶液。將培養皿放入37℃恒溫培養箱中，12h取出觀察結果。

1.7 結果判定 使用游標卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑(mm)=所測得的直徑平均數-8mm。

1.8 統計學方法 使用Ecxel匯總數據，SPSS18.0統計軟件行統計分析，P值<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌接種于血瓊脂培養基培養24h后取出可見金黃色菌落形成，接種MRSA的離心管經增菌培養后16h后可見試管內溶液渾濁，而僅含有營養肉湯培養基的離心管中仍清亮。提示MRSA細菌生長良好，以營養肉湯為對照，測得原菌懸液OD值為1.375。經過倍比稀釋后測得細菌懸液OD值為0.534。倍比稀釋后的菌懸液再經梯度稀釋后涂板測得細菌濃度為1.76×109CFU/ml，故經過生理鹽水稀釋100倍后再倒入MH瓊脂培養基中的細菌濃度為1.76×106CFU/ml。

2.2 6名健康志愿者全血中所含血小板計數為(161±19.2)×109/L，經2次離心法手工制備的PRP中血小板值為(876.3±73.3)×109/L，血小板富集倍數平均為5.4倍，符合PRP的制備標準。

2.3 打孔法抑菌實驗中，在PRP中加入葡萄糖酸鈣—凝血酶溶液后，10min內迅速凝固成塊激活形成PRG，而PRP在平板中緩慢擴散并凝固。在冷卻至45℃的瓊脂培養基中預加菌液后使用傾注平板法，所制備的平板菌落分布均勻，重復性好。在培養12h后取出觀察可見：40U/ml的慶大霉素溶液組產生明顯的抑菌圈，其平均直徑大小為(17.15±0.96)mm，而PRP及PRG組與滅菌純水一致，均無抑菌圈產生。見圖1。

圖1 培養12h后抑菌圈產生情況

注：左上角“P”代表PRP，右上角“G”PRG，左下角“+”代表慶大霉素，右下角“-”代表滅純水。

3 討論

富血小板血漿的抗菌效應研究由來已久，關于其抗菌機制，目前更多的觀點將其歸功于高濃度的血小板及白細胞。血小板裂解后釋放的抗菌肽被認為是血小板的主要抗菌機制，一些抗菌肽可以通過破壞細菌的細胞膜，抑制微生物RNA的合成、蛋白的合成或者蛋白折疊，滅活細菌毒素，激活細菌的自溶系統。血小板還能介導炎性細胞的趨化，也被認為是其抗菌的主要機制[7-8]。

而關于富血小板血漿中所含白細胞抗菌作用目前仍有爭議，傳統觀點認為，白細胞介導細胞免疫，在機體抵御外來感染的斗爭中占據主導地位，而Mariani等人[9]通過體外抗菌實驗研究了含不同白細胞的PRP制劑對一些細菌的抗菌效應，得出白細胞的存在并不會增加血小板在體外抗菌效應。

對于富血小板血漿的抗菌譜，目前的研究認為PRP及PRG對包括甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯桿菌、白色念珠菌、口腔鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌等可能存在抗菌效應，由于所納入的研究眾多，菌種不同、實驗條件、實驗方法及對象差異也較大，因此即便是對同一種細菌，不同的研究也可能得出不同的結論。如吳兵[10]以免血制備PRP與抗生素聯合使用的實驗中，未能發現PRP對金黃色葡萄球菌的抑制效果。楊閻峙等[11]以健康志愿者靜脈血制備PRP進行體外抗菌實驗，得出結論為富血小板凝膠對大腸桿菌及銅綠假單胞菌無明顯抑菌作用。PRP 對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及銅綠假單胞菌均無明顯抑菌作用。而?etinkaya等[6]研究表明PRP和PPP在體外對MRSA、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌有抑制作用。不僅如此，在一些大型的臨床研究中依然存在不同的結論[12-13]。一方面目前許多的體外研究實驗所采用的方法為時間—抑菌曲線法，而這種方法存在一個非常關鍵并且容易被忽略的問題：所有時間抑菌曲線法都需要配置反應管，在共混合物培養中，PRP會被其余加入的物質稀釋，可以認為在加入反應管之前的物質是PRP，但存在于反應管內的物質由于其血小板濃度被稀釋后已達不到PRP標準甚至低于全血，故此種方法得出的結論可靠性有待考量。由于MRSA多重耐藥的特性，在骨科領域中，其治療一直是許多外科醫師所頭疼的問題，并且近年來MRSA檢出率逐漸增高，由其感染所致的骨髓炎患者，常常需要多次手術，并且存在終身不愈的風險。為了明確PRP或PRG能否對MRSA臨床菌株有抗菌效果，為骨科領域中難愈性感染的治療提供新的參考，故本實驗采用定性實驗設計，通過紙片擴散法原理，在不改變PRP使用濃度的情況下，觀察抑菌圈的有無及大小來求證。

在本實驗中，筆者選擇含枸櫞酸鈉的藍色蓋頭一次性真空采血管作為血小板的保存劑，是由于該采血管相比含乙二胺四乙二酸鹽的紫色蓋頭管更有利于血小板的保存，并且枸櫞酸鹽對人體安全性更高，采血管獲取方便。在實驗前，查閱了骨髓炎患者MRSA的耐藥情況并收集了本院相關資料，發現MRSA對于臨床上常用于沖洗創口的慶大霉素耐藥率相對不高，并且于實驗前已將菌種送檢藥敏證實其對慶大霉素敏感，故本實驗陽性對照組采用慶大霉素。由健康志愿者全血經過離心后血小板濃集倍數達到了目前公認PRP的標準，是一種實用、經濟、安全的制備方法。制備過程中需要注意的是，初次離心后白膜層富含大量的血小板，確保吸取轉移至二次離心，在二次離心后仍然可見到白膜層，移去較多的血清可以進一步提高PRP中血小板的濃度。制備后的PRP需要充分搖勻以確保血小板分布均勻，否則由于離心后大量的血小板沉淀在管底，將使測得的PRP中的血小板數量比實際偏低[14]。同時本實驗采用的預加菌液傾注平板法[15]，制備的帶菌平板細菌分布均勻，可以避免普通的涂布法出現細菌分布不均的情況，打孔法使得藥物能夠在瓊脂中均勻擴散，彌補了紙片擴散法的不足，使該實驗可行性及重復性得到提高，并且在條件許可下盡量選擇較低的細菌濃度，以利于觀察細微的變化。 在PRG組中的平板孔中加入葡萄糖酸鈣—凝血酶復合物時，可以明顯地看到，在10min內PRP迅速于滴加藥物的位置凝聚成塊形成PRG。而PRP組血小板均勻向瓊脂周圍擴散，于孔邊緣緩慢凝固。在恒溫培養箱中培養12h后，慶大霉素組產生均勻的抑菌圈，邊界清晰，識別度高，平均抑菌圈直徑為(17.15±0.96)mm。PRP組及PRG組同陰性對照組在本次實驗中均未看到抑菌圈產生，提示健康志愿者全血所制備的PRP及其激活產物PRG對MRSA臨床菌株無抗菌效應，PRP及PRG對臨床上MRSA感染控制可能無益。

由于研究條件的限制，本實驗仍然存在著不足：(1)由于實驗所需血液樣本并不多，納入的研究對象不大，并且實驗對象為健康志愿者，有別于住院患者。由于創傷、感染等多重因素刺激，患者體內的血小板水平往往較高，經過同樣的方法制備的PRP其血小板水平與健康人不在同一水平。(2)本實驗中觀察時間選定為12h，盡管一些文獻中PRP和細菌共培養24h或者48h后仍能夠產生抑菌圈[16]，但一些學者通過繪制時間—抑菌曲線的研究認為PRP發揮抗菌效應有時效性，維持時間較短，并且PRP發揮的是抑菌作用而非殺菌作用，當這種抑制作用消失后，細菌又會繼續生長。而本實驗為定性實驗設計，抑菌圈的形成需要未被抑制生長的細菌不斷傳代而顯示，無法了解實驗組周圍細菌每一時間的活性變化，并且在能夠產生肉眼可辨的抑菌圈情況下，選擇了盡可能低的細菌濃度，但這種濃度與臨床上患者傷口中細菌濃度仍有差異。(3)本實驗中PRP及PRG對MRSA無抑菌效應，但臨床上感染該細菌的患者通常都會使用諸如萬古霉素之類的強效抗生素，在這類患者中PRP或PRG的使用是否會影響抗生素的抗感染效果不得而知。此外，體外實驗僅針對體外環境，可以作為體內實驗的參考，在體內是否也是如此結論，有待于進一步研究。