依那普利對糖尿病大鼠腎臟NF-κB、TGF-β1表達的影響

李文晶 常向云 孫侃 易嘉岱 唐劍

[摘要] 目的 通過觀察依那普利對糖病尿大鼠腎臟中核轉錄因子-κB（NF-κB）、轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達的影響，探討其對糖尿病腎病的作用及可能的機制。 方法 ①健康雄性SD大鼠（n=60）適應性喂養2周后隨機分為兩組。鏈脲佐菌素作用于待造模組（n=50），劑量為一次性35 mg/kg，之后2周繼續給予高糖高脂飼料，進行糖尿病造模。成模大鼠（n=40）隨機分為依那普利干預組（n=20）和模型組（n=20）。依那普利干預組給予依那普利10 mg/（kg·d）灌胃;正常組和模型組以等量蒸餾水灌胃。模型組和依那普利干預組繼續高脂高糖飼料喂養。②各組分別干預8周后，對比以下指標：一般狀況、血液生化指標、腎臟組織切片HE染色結構變化、行免疫組織化學染色測定腎臟中NF-κB、TGF-β1表達。 結果 ①雄性SD大鼠的最終存活數：正常組10只、模型組8只、依那普利干預組10只。②正常組的體重為（407.86±23.0）g/只，TC、TG、FBG、HbA1c值分別為（1.67±0.22）mmol/L、（0.68±0.11）mmol/L、（5.07±0.30）mmol/L、（4.44±0.66）%。與正常組比，模型組[（313.18±21.72）g/只和依那普利干預組（334.65±26.23g/只）體重明顯減輕（P<0.05）;模型組和依那普利干預組TC、TG、FBG、HbA1c值分別為（2.77±0.23）mmol/L和（2.66±0.33）mmol/L、（2.05±0.17）mmol/L和（2.01±0.19）mmol/L、（14.11±1.54）mmol/L和（13.91±1.43）mmol/L、（11.37±0.67）%和（10.73±1.28）%，較正常組有明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。③腎臟切片HE染色可見模型組有腎臟組織病理損害的改變，而依那普利干預組改變介于正常組和模型組之間;④免疫組化染色后可見模型組腎小球內著色明顯，腎間質、腎小管著色明顯較正常組深，NF-κB、TGF-β1含量增高，差異有統計學意義（P<0.01），依那普利干預組低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01），高于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）。 結論 ①依那普利可以延緩糖尿病腎臟硬化及纖維化的過程;②依那普利可以通過下調DM大鼠腎臟組織中NF-κB和TGF-β1的表達改善DM腎臟病變。

[關鍵詞] 馬來酸依那普利;糖尿病腎病;核轉錄因子-κB;轉化生長因子-β1

[中圖分類號] R587.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1672-4062（2019）10（a）-0001-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of enalapril on the expression of nuclear factor-kappa B （NF-κB） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in the kidney of diabetic rats with urinary tract， and to explore its effect on diabetic nephropathy mechanisms. Methods 1.Healthy male Sprague-Dawley rats （n=60） were randomly divided into 2 groups after 2 weeks of adaptive feeding. Streptozotocin was applied to the module to be fabricated （n=50） at a dose of 35 mg/kg， and the high-sugar and high-fat diet was continued for 2 weeks to perform diabetes modeling. Model rats （n=40） were randomly divided into enalapril intervention group （n=20） and model group （n=20）. The enalapril intervention group was given enalapril 10 mg/（kg·d） intragastrically; the normal group and the model group were orally administered with distilled water. The model group and the enalapril intervention group continued high-fat and high-sugar diet feeding. After 8 weeks of intervention in each group， the following indicators were compared： general condition， blood biochemical index， HE staining structure change of kidney tissue section， immunohistochemical staining to determine the expression of NF-κB and TGF-β1 in the kidney. Results 1.The final survival number of male SD rats： 10 in the normal group， 8 in the model group， and 10 in the enalapril intervention group. The body weight of the normal group was （407.86±23.0）g/head， and the values of TC， TG， FBG and HbA1c were （1.67±0.22）mmol/L， （0.68±0.11）mmol/L， （5.07±0.30）mmol/L and （4.44±0.66）%， respectively. Compared with the normal group， the model group （313.18±21.72）g/head and the enalapril intervention group （334.65±26.23）g/head] were significantly reduced in body weight，the difference wasstatistically significant（P<0.05）; the model group and the enalapril intervention group TC， The values of TG， FBG and HbA1c were （2.77±0.23）mmol/L and （2.66±0.33）mmol/L， （2.05±0.17）mmol/L and （2.01±0.19）mmol/L，（14.11±1.54）mmol/L and（13.91±1.43）mmol/L，（11.37±0.67）% and （10.73±1.28）% were significantly increased，the difference was statistically significant（P<0.01）. The HE staining of the kidney section showed that the model group had the pathological damage of the kidney tissue， while the enalapril intervention group changed between the normal group and the model group. 4. After the immunohistochemical staining， the model group showed the glomerular coloration. Obviously， renal interstitial and renal tubular staining was significantly deeper than normal group， NF-κB and TGF-β1 levels were increased，the difference was statistically significant（P<0.01）， and enalapril intervention group was lower than the model group，the difference was statistically significant（P<0.01） than normal group，the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion 1. Enalapril can delay the process of diabetic kidney hardening and fibrosis; 2. Enalapril can improve DM nephropathy by down-regulating the expression of NF-κB and TGF-β1 in the kidney tissue of DM rats.

[Key words] Enalapril maleate; Diabetic nephropathy; Nuclear transcription factor-κB; Transforming growth factor-β1

糖尿病（diabetes mellitus，DM）的發病率在全世界范圍內有逐年增高趨勢，在我國年齡標準化后DM的發病率高達10%[1]。糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是DM代謝異常引發的嚴重的并發癥，是DM全身微血管病的組成。DN的特征病理改變是腎小球硬化，腎小球和腎小管基底膜增厚及間質增生和纖維化[2]。DN的發病機制復雜，目前認為由高血糖介導的血流動力學、氧化應激、炎癥因子等途徑導致腎臟損傷，迄今DN發生的確切機制不完全清楚[3]。NF-κB是一種轉錄因子，在各種組織細胞中廣泛存在，通過上調如TGF-β1等多種炎性反應因子的表達，加重腎小球的炎性損傷，是炎性反應的關鍵調控因子[4-5]。TGF-β1是一種具有調節細胞生長分化的活性多肽，腎臟中TGF-β1分布于腎小管、腎小球與腎間質中，于DN的進展中有著非常重要的作用[6]。馬來酸依那普利是血管緊張素轉化酶抑制藥（ACEI），主要通過抑制腎臟及其他組織的血管緊張素轉化酶（ACE）而使血漿血管緊張素II（Ang II）水平降低而發揮作用，但對DN的保護作用研究較少。該實驗則通過觀察馬來酸依那普利對糖尿病大鼠腎臟 NF -κB、TGF-β1表達的影響，來探討ACEI類藥物在保護糖尿病大鼠腎臟中可能具有的作用，報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 動物與試劑

健康雄性SD大鼠60只，體重（180±20）g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，4周齡，清潔級。大鼠飼料（標準型顆粒飼料為原料加入0.3%豬膽鹽、5.0%膽固醇、10.0%豬油、3.0%雞蛋黃、15.0% 蔗糖配制而成）購自瑪祖瑞（mazuri）大鼠飼料公司。馬來酸依那普利購自江蘇揚子江制藥股份有限公司。NF -κB、TGF-β1抗體購自北京博奧森公司。鏈脲佐菌素（Streptozotincin，STZ）購自Sigma公司。

1.2? 分組及模型制備

健康雄性SD大鼠（n=60）適應性喂養2周后隨機分為兩組，待造模組（n=50）一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg破壞部分胰島β細胞，建立糖尿病大鼠模型，高脂高糖飼料喂養2周;正常組（n=10）給予等體積枸櫞酸緩沖液腹腔注射，普通飼料喂養2周;采大鼠尾尖部靜脈血測定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），2次FBG均超過16.7 mmol/L者為DM造模成功[7]。成模大鼠（n=40）隨機分為模型組（n=20）和依那普利干預組（n=20）。依那普利干預組給予依那普利10mg/（kg·d）灌胃。正常組和模型組以等量蒸餾水灌胃。模型照組和依那普利干預組繼續高脂高糖飼料喂養。依那普利干預8周后實驗結束。飼養動物總計12周。

1.3? 血液標本檢測

所有大鼠于第12周末在腹腔按0.5 mL/100 g注射麻藥（地西泮、阿托品、氯胺酮注射液各一只與等量生理鹽水稀釋），于腹主動脈采血高速離心后分離血清，用全自動生化檢測儀測定TC（總膽固醇）、TG（總甘油三酯）、FBG（空腹血糖），高壓液相色譜法測定HbA1c（糖化血紅蛋白）。

1.4? 蘇木素-伊紅染色

所有大鼠于第12周末在腹腔按0.5 mL/100 g注射麻藥（地西泮、阿托品、氯胺酮注射液各一只與等量生理鹽水稀釋），剝離大鼠兩側腎臟，縱向剖開去掉包膜的腎臟，摘取完整扇形組織（包括腎髓質及腎皮質）。4%多聚甲醛灌注固定腎臟組織、酒精梯度脫水、石蠟包埋切片（ 5 μm）。石蠟包埋組織切片依次經過二甲苯脫蠟、酒精脫水、蘇木精染色、乙醇漂洗、酒精脫水、伊紅復染、酒精脫水、二甲苯透明行常規HE染色，光鏡下（×200）觀察大鼠腎臟的形態結構改變。

1.5? NF-κB、TGF-β1免疫組織化學染色

大鼠腎臟切片經過脫蠟、置換二甲苯、高壓熱修復之后冷卻至室溫;3%過氧化氫室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，5 min×3次;滴加兔抗大鼠NF-κB、TGF-β1抗體（第一抗體）4℃冰箱過夜。PBS沖洗，5 min×3次; 依次滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG聚合物（生物素第二抗體）37℃烘箱孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3次;，DAB顯色試劑盒（1∶100）顯色，蘇木素復染，分化，返藍;梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。出現黃棕色為陽性染色，光鏡下于低倍鏡后轉入高倍鏡觀察，分別進行NF-κB、TGF-β1定量評分： 每張切片隨機選取10個腎小球，在高倍鏡（×200）視野下陽性表達呈棕黃色。NF-κB、TGF-β1表達水平采取陽性染色面積評分與陽性染色強度評分的乘積表示。

1.6? 統計方法

采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據，對所有數據進行正態性檢驗，服從正態分布的數據采用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析;不服從正態分布的數據采用M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗，多組間比較采用多個獨立樣本非參數分析Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1? 一般狀況

大鼠的最終存活數：正常組為10只、模型組為8只、依那普利干預組為10只。

模型組和依那普利干預組較正常組飲食、尿量增加，毛色干枯，死亡率高，體重減輕明顯，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。模型組和依那普利干預組間差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2? 血生化檢測

模型組和依那普利干預組TC（總膽固醇）、TG（總甘油三酯）、FBG（空腹血糖）、HbA1c（糖化血紅蛋白）水平較正常組有明顯升高，差異有統計學意義（P<0.01）。而模型組和依那普利干預組間差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.3? 腎臟組織結構變化

經HE染色后正常組腎小球、腎小管分布均勻，結構清晰，腎間質未見炎性反應細胞浸潤。模型組可見腎小球體積增大，小管上皮細胞、間質水腫，局灶小管壞死。依那普利干預組鏡下結構腎小球病變均有改善，介于模型組和正常對照組之間，見圖1。

2.4? NF -κB染色結果

經免疫組化染色后NF-κB在正常組極少量表達，著色淺;模型組腎小球內著色明顯，腎間質、腎小管著色明顯較正常對照組深;依那普利干預組腎小球、腎間質、腎小管著色較糖尿病對照組變淺，但較正常對照組變深，見圖2。

2.5? TGF-β1染色結果

經免疫組化染色后TGF-β1在正常組著色淺，表達很少，無陽性著色;與正常組相比，模型組著色深，腎小管上皮細胞、髓質的表達明顯增加，呈強陽性表達;依那普利干預組腎小球、腎間質、腎小管著色較模型變淺，但較正常對照組深，見圖3。

2.6? NF-κB、TGF-β1表達情況

依據免疫組化染色結果評分方法將NF-κB 、TGF-β1表達情況進行定量評分，并進行統計學分析處理，結果顯示：依那普利干預組NF-κB蛋白表達明顯低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01）且高于正常組，差異有統計學意義（P<0.01）;依那普利干預組TGF-β1蛋白表達明顯低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01）且高于正常組，差異有統計學意義（P<0.01），見表2。

3? 討論

糖尿病腎病是DM最主要的微血管并發癥之一，是現今世界上公認的終末期腎損傷（ERSD）最常見的致病原因，是糖尿病致死、致殘的主要原因。DN的發病機制復雜，由遺傳和環境相互作用，與血糖代謝失常、血流動力學改變、氧化應激、炎癥反應、細胞因子等有關[7-8]。DN特征性的病理改變是腎小球病變（包括腎小球體積增大、彌漫性GBM增厚、系膜增生、K-W結節形成）及腎小管萎縮與間質纖維化;大多數動物模型都只能誘導出早期DN病理改變（腎小球體積增大、系膜增生等）[9]。該研究發現模型組腎小球體積增大，小管上皮細胞、間質水腫，局灶小管壞死，符合DN的病理改變。依那普利干預后腎臟病理損害緩解，說明依那普利具有延緩DN 腎臟損傷的作用。

該實驗結果顯示進行腎臟免疫組化染色后發現NF-κB、TGF-β1在正常組極少量表達，著色淺;模型組著色明顯較正常對照組深;而依那普利干預組腎小球、腎間質、腎小管著色較糖尿病對照組變淺，但較正常對照組變深;同時進行免疫組化結果評分顯示依那普利干預組NF-κB、TGF-β1表達為2（2，2），高于正常組1（1，1）（P<0.01），低于模型組3（3，3.75）、3（3，3）（P<0.01）。其原因可能為RAAS系統在高血糖的刺激下激活，其中發揮重要作用的是AngⅡ，其在非血流動力學上一方面表現為其與相應受體結合后增加了內皮細胞的通透性以及腎小球濾過膜的通透性;相關研究[10]已經有過詳細的報道;另一方面可以促進包括NF-κB和TGF-β1在內的多種細胞因子的表達[11]。多項研究[12]發現使用ACEI后大鼠腎組織中NF-κB活性較未使用ACEI組明顯下降，并且減輕了腎臟損害;同時AngⅡ可以激活NF-κB的轉錄。有研究[13]發現DM大鼠腎組織AngⅡ含量、NF-κB平均吸收光密度值分別為（15.42±3.27）ng/g，（8.96±2.01），明顯高正常組[（7.05±1.32）ng/g，（1.14±0.17）]（P<0.05）;經依那普利治療后為[（9.73±2.02）ng/g，（4.55±1.01）]明顯減輕（P<0.01），與該實驗得出的結論相符。有研究[14]顯示用厄貝沙坦干預糖尿病大鼠后，干預組TGF-β1mRNA表達為（2.9±0.5），明顯高于對照組（1.8±0.4）（P<0.05），低于DM模型組（8.6±2.2）（P<0.05），可減少腎臟局部TGF-β1的表達，減緩間質纖維化。在高血糖長時間狀態下AngⅡ會利用TGF-β1啟動子內的高糖反應元件與高糖結合刺激其基因的轉錄，使其表達增加而激活TGF-β1/Smads信號通路[15]。由此可見在整個糖尿病腎病進展中AngⅡ可以通過與NF-κB和TGF-β1的直接作用、間接作用以及三者之間的相互作用介導糖尿病腎臟的損害，而ACEI類藥物如該實驗的依那普利則通過抑制AngⅡ的作用從而達到延緩糖尿病腎臟硬化和纖維化的進程。

綜上所述，該實驗進一步探究了ACEI類藥物對糖尿病腎病的保護機制，為ACEI類藥物對糖尿病腎病的作用提供了理論依據，為DN的防治提供了新的可能的靶點。但糖尿病腎病的發病機制十分復雜，確切的作用機制尚有待進一步探討。

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（收稿日期：2019-07-07）