大鱗副泥鰍氣單胞菌混合感染的診斷與治療

唐慶權 徐婷婷 陶敏慧 毛穎睿 張子涵 魯子怡 樊慧敏 許曉牧 彭開松 王黎明 鮑傳和 薛貴勝 朱若林 李明

摘要?為探明大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）潰爛病的病原，并篩選有效的外用和內服藥物，進行了細菌分離鑒定、毒力基因檢測、人工感染、藥物篩選和治療試驗。結果表明，分離菌N-1株為中間氣單胞菌，N-2株和N-3株為凡隆氣單胞菌，且攜帶氣溶素aerA、細胞毒性腸毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip等毒力基因。N-1、N-2、N-3對應的半數致死濃度分別為105.21、105.88、105.53 CFU/尾，外用和內服藥分別優先選擇優力克和氟苯尼考。中間氣單胞菌和凡隆氣單胞菌可引起大鱗副泥鰍皮膚潰爛病，優力克外潑和氟苯尼考內服可治療該病。

關鍵詞?大鱗副泥鰍;皮膚潰爛;氣單胞菌;氟苯尼考

中圖分類號?S947文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0088-03

Abstract?To identify the pathogen of Paramisgurnus dabryanus canker and screen effective drugs for external and internal use，bacterial isolation and identification，virulence gene detection，artificial infection，drug screening and treatment experiment were carried out.The results showed that N1 isolate was Aeromonas media，N2 and N3 were Aeromonas veronii，which carried virulence genes such as aerosol aerA，cytotoxic enterotoxin Act，flagellum Fla and esterase Lip.Half lethal concentrations of N1，N2 and N3 were 105.21，105.88 and 105.53 CFU/tail，respectively.The external and internal medicines were preferred to YouLike and florfenicol，respectively.Aeromonas rmedia and Aeromonas veronii could cause skin ulceration of P.dabryanus，which could be treated by external spraying of YouLike and oral administration of florfenicol.

Key words?Paramisgurnus dabryanus;Skin ulceration;Aeromonas spp.;Florfenicol

大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）又稱臺灣泥鰍，隸屬鯉形目鰍科。隨著大鱗副泥鰍養殖密度的不斷增加，水產病害問題日益嚴重，且以溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）[1]、創傷弧菌（vibrio vulnificus）[2]、泥鰍氣單胞菌（Aeromonas misgurnus）[3]、凡隆氣單胞菌（Aeromonas veronii）[4]等細菌感染最為嚴重。然而，迄今為止尚未見中間氣單胞菌感染大鱗副泥鰍的報道。

氣單胞菌屬（Aeromonas）成員廣泛分布于淡水、污水、淤泥、土壤等自然環境，也是重要的人類條件致病菌，能夠引起腸道、血液、皮膚和軟組織的感染[5]。2017年4月安徽省定遠縣的某工廠化養殖場的大鱗副泥鰍繁殖親本發生大面積皮膚潰瘍。筆者對該病例的病因分離和治療進行了報道，以期為類似疾病防控提供參考。

1?材料與方法

1.1?臨床診斷分析?對發病前后的水質、寄生蟲和飼養管理進行分析。

1.2?細菌分離純化及鑒定

無菌取患病大鱗副泥鰍（全長10～15 cm）肝胰臟、脾臟截面涂布于營養瓊脂，28 ℃下培養16 h，觀察菌落形態;參照杭州微生物試劑有限公司的操作手冊進行革蘭氏染色、氧化酶試驗、細菌生理生化鑒定。參照朱若林等[6]的方法進行16S rRNA基因擴增、系統進化分析和毒力基因檢測。

1.3?攻毒試驗?健康大鱗副泥鰍，體長（8.5±1.1） cm，體重（5.1±0.2） g，飼養在曝氣自來水中，水溫28～31 ℃。每株菌的攻毒試驗設6個劑量組：0（空白對照）、105、106、107、108和109 CFU/mL，每組20尾泥鰍。試驗期間，按攝食狀況少量投餌，不排污。觀察14 d，取瀕死或剛死泥鰍，重新進行細菌分離鑒定。

根據上面測定的半數致死濃度，進行混合攻毒試驗，每組20尾大鱗副泥鰍，攻毒菌液濃度107 CFU/mL，單株菌注射時，劑量為0.1 mL/（尾·株）;2株菌混合感染時，每株菌注射0.05 mL/（尾·株）;3株菌混合時，每株注射0.033 mL/（尾·株）。

1.4?外用和內服藥物篩選

參考商業檢驗標準（SN/T 3229—2012）[7]，采用稀釋-中和法篩選外用消毒劑。參考歐盟標準[8]，采用紙片法和微量肉湯稀釋法進行內服抗菌藥物（購自中國獸藥監察所）的藥敏試驗。

2?結果與分析

2.1?臨床診斷分析

發病池水溫在25～28 ℃，水質指標良好。患病大鱗副泥鰍體表黏液增多，體表的中部、尾部出現圓形潰爛。解剖發現脾臟暗紅，肝胰臟發黃，蒼白。水浸片鏡檢未見寄生蟲。

2.2?細菌形態學生理生化鑒定

從3尾患鰍肝胰臟分別分離純化得到3株優勢菌，命名為N-1株、N-2株、N-3株。營養瓊脂平板上28 ℃培養16 h后，菌落呈乳白色，表面光滑，圓形凸起，邊緣整齊;3株菌均為革蘭氏陰性菌，且6% NaCl胨水和1 %NaCl枸櫞酸鹽試驗均顯示陰性，而氧化酶、精氨酸、葡萄糖產氣、蔗糖、甘露醇試驗均顯示陽性。此外，N-1株賴氨酸試驗呈陰性，而N-2株、N-3株賴氨酸試驗呈陽性。經生化編碼鑒定，可判定3株細菌均為氣單胞菌屬成員。

N-1株、N-2株和N-3株的16S rRNA基因測序BLAST比對顯示，其分別與中間氣單胞菌、凡隆氣單胞菌的相似性最高，均為99 %，系統發育樹如圖1所示。，綜上可確定N-1株為中間氣單胞菌，N-2株和N-3株為凡隆氣單胞菌。

使用 Mega 4軟件進行多序列匹配分析后，采用鄰位相連法（Neighborjoining method）構建系統發育樹，所構建發育樹各分支的置信度由 Bootstrap 進行 1 000 次循環檢驗。

從中間氣單胞菌N-1株中檢出的毒力基因有氣溶素aerA、細胞毒性腸毒素Act、熱不穩定性腸毒素Alt、鞭毛Fla、彈性蛋白酶ahyB、酯酶Lip（圖2）等6種毒力基因;從凡隆氣單胞菌N-2、N-3株中檢測出的毒力基因有氣溶素aerA、細胞毒性腸毒素Act、鞭毛Fla、酯酶Lip（圖2）等4種毒力基因。

2.3?攻毒試驗

大鱗副泥鰍在攻毒后3～7 d相繼發病，采用簡化寇氏法計算LD50發現，中間氣單胞菌N-1株、凡隆氣單胞菌N-2株、凡隆氣單胞菌N-3株對應的半數致死量（LD50）分別為105.21、105.88、105.53 CFU/尾。死亡的大鱗副泥鰍主要表現為皮膚點狀出血和鰭條出血，未見皮膚潰瘍。人工感染后發病泥鰍肝胰臟分離菌為攻毒所用菌株。混合感染死亡率見表1。

2.4?有效藥物篩選和治療結果

對市場上效果比較認可的3種含碘制劑（優力克、迪碘和蛋氨酸碘）進行了非清潔條件和清潔條件下的最小抑菌濃度試驗。3種碘制劑在清潔條件下的MIC大于500 μL/mL，但綜合比較3種碘制劑的效價比，以優力克（嘉興綠望生物科技有限公司）最高，且考慮優力克能促進創傷愈合，后續治療中選擇優力克的池效果也最好。綜合紙片法測定敏感性定性結果（表2）和肉湯法測定的MIC定量結果（表3）可知，可使用的國標漁藥中最優選擇為氟苯尼考。

由于筆者介入此案例治療時，死亡已經發生7 d，且部分（40%～70%）泥鰍的潰瘍面積已經超過了體表面積的10%以上，且已經爛到肌肉。外用優力克（0.5 g/m3）3次，每隔1 d 1次;內服氟苯尼考（25 mg/kg體重）和多維適量，連續7 d。7 d后死亡終止，創傷面積小于10%且僅真皮層沒有完全爛透的泥鰍也逐步恢復。但是，該病例介入治療已經比較晚，導致部分池的死亡率高達90%。

3?討論

在泥鰍養殖過程中，皮膚相關疾病多發，一般最開始表現為多發性點狀出血病、如不及時治療會進一步發展為赤皮、腐皮、潰爛、爛鰭等。引起這些癥狀的細菌以氣單胞菌科成員最為常見[3，9-10]。當環境不良、體表損傷、應激等均可誘發氣單胞菌感染[11]，該案例中的大鱗副泥鰍有不同程度的體表擦傷，是中間氣單胞菌和凡隆氣單胞菌繼發感染的誘因。患病大鱗副泥鰍是由中間氣單胞菌（N-1）和凡隆氣單胞菌（N-2、N-3）混合感染引起，其引起的死亡率要比單一菌株感染高。目前，有關大鱗副泥鰍凡隆氣單胞菌感染的報道已有2例，分別發生在撫州市[12]、遼寧省[13]，報道中患病大鱗副泥鰍癥狀以出血潰瘍為主，與該研究中情況相似。有關大鱗副泥鰍中間氣單胞菌感染的報道尚未發現，但關于中間氣單胞菌感染水產動物的研究報道已有2例，分別發生在成都[14]和湖南常德[15]，報道中患病魚癥狀均以出血為主。

氣單胞菌屬細菌可單獨或與其他病原菌混合感染[3]。其致病性與多種胞外水解酶（如脂肪酶和蛋白酶）和非酶類毒力因子（細胞毒性腸毒素、氣溶素等）有關，這毒力因子有助于細菌入侵和感染的建立[16-17]。

氣單胞菌的耐藥性日益嚴重，因此處理臨床病例時，需進行藥敏試驗，才能科學用藥[18]。該案例的中間氣單胞菌和凡隆氣單胞菌對藥物的敏感性結果與上述報道菌株的藥敏結果差異明顯。綜合評價內服以國標漁藥氟苯尼考最優，外用以新型創傷愈合促進消毒劑優力克最好。

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