miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲狀腺癌中的表達及其診斷價值分析

梅士娟，張雙元，張易青，馬淑梅，孔令達

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腫瘤，全球每年約新發(fā)30萬例，死亡4萬例[1-2]。甲狀腺乳頭狀癌是最常見的組織學類型，占所有甲狀腺癌的80%～90%，10年生存率超過90%，但若發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(在5%～20%的甲狀腺全切除術(shù)患者中可觀察到區(qū)域復發(fā)) ，尤其是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(占所有患者的20%～50%)，易導致生存率降低[3-4]。由于甲狀腺癌患者存活和腫瘤復發(fā)的危險因素存在差異，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對預后的影響存在爭議。因此，急需尋求生物敏感標志物解決這一問題[5]。微小RNA(miRNA)是小的(19～25個核苷酸)非編碼單鏈RNA，其在癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)過程中起重要作用。與未受影響的甲狀腺組織相比，已顯示幾種miRNA在甲狀腺癌中轉(zhuǎn)錄失調(diào)[6-8]。miR-221-3p過表達與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，隨后證實與其他類型癌癥的轉(zhuǎn)移發(fā)展相關(guān)。miR-125b-5p上調(diào)與非小細胞肺癌、肝細胞癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]。相反，miR-125b-5p下調(diào)也與透明細胞腎細胞癌、胃癌和復發(fā)性漿液性乳頭狀卵巢腺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。miR-183-5p是最早被發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，它的上調(diào)與多種癌癥相關(guān)。現(xiàn)分析miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p在甲狀腺癌中的表達及其診斷價值，為甲狀腺癌的治療提供臨床及理論依據(jù)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年4月—2018年12月青海大學附屬醫(yī)院腫瘤外科確診并有完整隨訪資料的甲狀腺乳頭狀癌患者138例，經(jīng)臨床頸部超聲診斷及甲狀腺全切除或次全切除術(shù)后病理檢查確診，術(shù)前均未接受化療或放療。其中男69例，女69例，年齡47～68(57.5±10.8)歲；病程4～25個月，平均(6.5±2.4)月；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期88例，Ⅲ～Ⅳ期50例。手術(shù)切除標本后行病理檢查以判定腫瘤大小、復發(fā)、臨床分期、血管間隙浸潤、轉(zhuǎn)移。選擇同期于醫(yī)院診治的甲狀腺結(jié)節(jié)患者138例作為對照組(自愿提供甲狀腺組織用作分析miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p的表達)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：患者的預計生存期均>3個月。(2)排除標準：同步接受其他腫瘤放療的患者；服用或可能服用致肝損害藥物的患者；存在其他重大器官疾病的患者。

1.3 觀測指標與方法 通過TRIzol試劑(碧云天科技公司)提取總RNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳和UV分光光度計(美國HyClone公司)檢查RNA樣品的純度和濃度。使用2 μg總RNA及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Sigma公司)合成cDNA。引物由上海生工科技公司合成。miR-221-3p正向引物為5'-CCTGAGATGCAGGGTCCGAGGTAGGTCTA-3'，反向引物為5'-TTGCGGACATTGCTTGCTA-3'；miR-125b-5p正向引物為5'-CCTGACCTGCTAGGTAGCCTG-3'，反向引物為5'-CTGATCGTAGCTTGCTATTGCTGA-3'；miR-183-5p正向引物為5'-GGTTTCATCCAGGATCGAGCAGG-3'，反向引物為5'-ACAAAGATGGTCACGGTCTGCC-3'；內(nèi)源性對照GAPDH正向引物為5'-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3'，反向引物為5'-GCACTGTGTTGGCGTACAGG-3'。PCR反應條件為95℃ 5 min，然后進行30個循環(huán)，95℃ 30 s，58℃ 30 s和72℃ 60 s，72℃10 min。PCR反應系統(tǒng)：cDNA 2 μl +每種引物3 μl +Taq聚合酶(Sigma公司生產(chǎn))0.5 μl +dNTP 1 μl +10×緩沖液2 μl，加入生理鹽水以使最終體積為20 μl。以GAPDH作為內(nèi)部對照，以2-ΔΔCt作為計算方法[10]，依據(jù)miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p mRNA 2-ΔΔCt計算結(jié)果，確定miR-221-3p>3.76、miR-125b-5p>5.43、miR-183-5p>6.21為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較 與對照組比較，病例組患者性別、年齡、基礎(chǔ)病、家族遺傳史、身高、體質(zhì)量、TG、HDL-C、LDL-C、舒張壓、收縮壓比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 2組一般情況比較

2.2 2組miRNA表達水平比較 與對照組比較，病例組miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p水平明顯升高(P<0.01)，見表2。

2.3 miRNA在甲狀腺癌患者中的變化特征 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p在甲狀腺癌的腫瘤較大、有復發(fā)、臨床Ⅲ～Ⅳ期、血管間隙浸潤、轉(zhuǎn)移中均升高(P均<0.01)，見表3。

表2 2組血清相關(guān)miRNA表達水平比較

表3 相關(guān)miRNA在甲狀腺癌患者中的變化特征 [例(%)]

2.4 診斷甲狀腺癌ROC曲線分析 miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p聯(lián)合篩查方法AUC、約登指數(shù)、敏感度、特異度、準確度均高于miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p單獨篩查方法(P<0.05)；miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p單獨篩查方法AUC、約登指數(shù)、敏感度、特異度、準確度相近，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

3 討 論

甲狀腺乳頭狀癌具有生物惰性，預后相對較好，然而，有10%～30%的甲狀腺乳頭狀癌病例表現(xiàn)出進展性并導致預后不良。因此，確定其發(fā)展的分子機制對甲狀腺乳頭狀癌的正確治療至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一類含有約22個核苷酸的內(nèi)源性小RNA，其通過靶向3'非翻譯區(qū)(3'UTR)上的序列來干擾蛋白質(zhì)翻譯過程。 通過負調(diào)節(jié)其靶基因的蛋白質(zhì)表達水平，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和進展中發(fā)揮重要作用，miRNA可能成為診斷、治療甲狀腺癌的潛在分子靶點。

圖1 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p診斷甲狀腺癌ROC曲線分析

miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p是與腫瘤相關(guān)的miRNA，據(jù)報道在許多類型的癌癥中發(fā)揮促進作用[10-12]。miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p通過上調(diào)不同的致癌基因可在大多數(shù)類型的癌癥中起腫瘤促進劑的作用。miR-221-3p可通過直接靶向SOX4促進上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(EMT)過程而在前列腺癌進展中充當腫瘤促進因子[13]；miR-221-3p通過促進樁蛋白(PXN)的表達，作為腫瘤轉(zhuǎn)移和胃癌侵襲的腫瘤促進因子發(fā)揮作用；miR-221-3p通過靶向SMAD2縮短細胞在G1/S期轉(zhuǎn)變中的停滯并促進細胞增殖，以及宮頸癌細胞中的EMT遷移和侵襲[14]。最近的一項研究表明，miR-221-3p通過靶向hedgehog信號通路受體patched-1促進胰腺癌細胞的生長和侵襲。

表4 miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p診斷甲狀腺癌ROC曲線分析

注： 與miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p比較,aP<0.05

miR-125b-5p的生物學功能與miR-221-3p相近。miR-125b-5p通過促進EGFR表達進而促進膠質(zhì)瘤和乳腺癌細胞系的遷移和侵襲[15]。在胰腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中，miR-125b-5p通過靶向MMP16促進遷移和侵襲，MMP16是一種對細胞外基質(zhì)具有蛋白水解活性的蛋白酶。另一方面，miR-125b-5p的過表達顯著增加了肝癌中的細胞遷移和侵襲性，其過表達與高風險和肝癌復發(fā)相關(guān)。miR-183-5p上調(diào)與透明細胞腎細胞癌、胃癌和肺癌的轉(zhuǎn)移復發(fā)有關(guān)[16]。在胃癌中，高水平miR-183-5p可促進細胞周期蛋白D1和p27表達，而周期蛋白D1和p27是明確的致癌因子[17]。本次研究結(jié)果顯示，與對照組比較，病例組miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p表達水平明顯升高。miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p陽性率與腫瘤進展相關(guān)明顯。這與上述討論符合，說明miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p在甲狀腺癌中表達增加，且與甲狀腺癌的進展密切相關(guān)。

miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p聯(lián)合篩查方法敏感度、特異度、準確度、AUC、約登指數(shù)均高于miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p單獨篩查方法。說明三者聯(lián)合篩查甲狀腺癌具有較高的價值。

綜上，miR-221-3p、miR-125b-5p與miR-183-5p在甲狀腺癌中表達增加，且與甲狀腺癌的進展密切相關(guān)，miR-221-3p、miR-125b-5p、miR-183-5p可能為甲狀腺癌的診斷、治療靶點。miR-221-3p+miR-125b-5p+miR-183-5p聯(lián)合篩查甲狀腺癌具有較高的敏感度、特異度、準確度，適合臨床推廣應用。