β-欖香烯聯合卡鉑對結腸癌SW480細胞放療增敏作用的實驗研究

文蘭香，覃世運，陳麗君，田雯，劉旭初，陳鐘勇

自20世紀80年代以來，癌癥已成為人類健康的主要威脅，癌癥的發病率逐年上升。結直腸癌全球每年有超過100萬例新病例和50萬例死亡[1]。在我國，每年有15萬例患者被診斷出結腸癌，并且有5萬人死于該疾病，其5年存活率為60%[2]。放射療法是結腸癌的治療策略[3-4]。喜樹堿、長春堿、紫杉醇等天然抗腫瘤藥物通常存在明顯的不良反應和耐藥性，因此人們越來越重視開發一種不良反應輕的抗腫瘤藥物[5]。β-欖香烯是從姜科植物中分離出來的一類天然萜烯類化合物，具有廣泛的生物活性，可治療再生障礙性貧血、抗腫瘤、改善骨髓功能、誘導細胞凋亡、體外抗HSV21病毒等[6-7]。Caspase-6是凋亡信號級聯中的關鍵半胱天冬酶。已經在由多種凋亡信號誘導的細胞凋亡中檢測到Caspase-3、Caspase-6，包括死亡受體激活、生長因子剝奪、電離輻射、不同化學治療劑[8-10]。本研究擬探討β-欖香烯聯合卡鉑對結腸癌SW480細胞放療增敏作用，為結腸癌的治療提供理論依據,報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗細胞、試藥試劑：人結腸癌SW480細胞(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)。RIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；改良Eagle's培養基(DMEM)(美國HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(美國卡爾斯巴德公司)；β-欖香烯、卡鉑(99.9%，美國Sigma公司)；胰蛋白酶、96孔板、二甲基亞砜、膜聯蛋白V/碘化丙錠雙染色試劑盒、乙二胺四乙酸酯、聚偏二氟乙烯膜、化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；碘化丙啶(PI)(南京生興生物技術有限公司)；3%瓊脂糖凝膠電泳膜、BCA蛋白定量分析試劑盒(BCA Protein Assay Kit)、二級山羊抗兔IgG抗體(美國Thermo Fisher Scientific公司)；多克隆兔抗Caspase-3蛋白、小鼠Caspase-6蛋白[圣克魯斯生物技術(上海)有限公司]。(2)儀器設備：ED-98X射線發生器(美國瓦里安技術中國有限公司)；ELx800酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；FACSCalibur96X流式細胞儀(美國BD公司)；AccessQuick RT-PCR系統(美國Promega公司)；GelDoc 2000 System/QuantityOne Software數字凝膠記錄系統[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)]。

1.2 實驗方法 2019年3— 5月于海南省第三人民醫院腫瘤中心分子生物實驗室進行實驗。SW480組：取結腸癌細胞系SW480細胞液(細胞濃度為5×106個/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于CO2培養箱(37℃、5%CO2、20% O2)；放療組：細胞培養方法同SW480組，使用X線發生器進行X線照射，以4 Gy/min的固定劑量率發射，照射孵育時間為24 h；β-欖香烯及卡鉑組：培養方法同SW480組，分別加入β-欖香烯、卡鉑，使其最終濃度分別為80.0 μg/ml、100 μg/ml；β-欖香烯聯合卡鉑+放療組： 細胞培養方法同SW480組，加入β-欖香烯、卡鉑(濃度分別為80.0 μg/ml、100 μg/ml)，使用X線發生器進行X線照射，以4 Gy/min的固定劑量率發射；用于照射細胞的X射線的能量分級為8 Gy，照射孵育時間為24 h。以上各組每孔設6個平行樣，培養72 h。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 SW480細胞增殖水平測定：用對數生長期的SW480細胞進行胰蛋白酶消化，并以5×103個/ml細胞密度接種于96孔板中。孵育24 h，添加MTT溶液200 μl，并繼續孵育4 h。隨后，棄去細胞上清液，并加入二甲基亞砜100 μl。將96孔板在室溫下輕輕搖動15 min，并用酶標儀測量570 nm處的吸光度(OD)值。細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)。

1.3.2 SW480細胞克隆形成數目測定：選擇處于對數生長期的細胞并通過移液將其懸浮于培養液中，然后接種到10 cm培養皿中，用梯度因子進一步稀釋細胞懸浮液。 將約500個細胞加入培養皿中，在37℃下培養2～3周直至出現可見的細胞克隆形成數目。用PBS輕輕洗滌培養皿2次。將細菌用甲醇5 ml固定15 min，用吉姆薩染色10～30 min，然后計數。計數含有至少50個細胞的細胞克隆形成數目。

1.3.3 SW480細胞凋亡測定：使用膜聯蛋白V/碘化丙錠雙染色檢測細胞凋亡。收集每組細胞，消化并重懸于PBS中。根據試劑盒提供方案，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。在流式細胞術圖中，左下象限代表細胞碎片，而右下象限分別代表早期和晚期凋亡細胞。 左上象限代表死細胞。根據以下公式計算每組的凋亡率：細胞凋亡率(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%，進行3次獨立測量取平均值。

1.3.4 SW480細胞周期測定：將對數生長期的細胞離心5 min，用PBS洗滌2次，并在70℃下用70%乙醇固定12 h。然后離心并收集細胞，將細胞用RNA酶A 50 μg/ml在PBS 100 μl中室溫下消化30 min，然后用碘化丙啶(PI)5 μl染色30 min，通過流式細胞術分析樣品。

1.3.5 SW480細胞Caspase-3、Caspase-6基因及蛋白表達測定：使用TRIzol試劑提取總RNA，并進行第1次ToRT反應。 總RNA 1 μg使用AccessQuick RT-PCR系統進行RT-PCR實驗。引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，序列如下：Caspase-3，正向5’-AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG-3’和反向5’-GACTTGGGAGGTATCCACATCC-3’；Caspase-6，正向5’-GAAATCGTGCGTGACATTA-3’和反向5’-ACTCATCGTACTCCTGCTTG-3’；β-catenin，正向5’-ATTCGATGACCTTGGAA-3’和反向5’-CCTGAGTCGTACTCCCTTCGT-3’。Caspase-3、Caspase-6、β-catenin擴增產物的預期長度分別為132、259、475 bp，在熱循環儀上進行PCR；94℃保溫2 min，然后在94℃保溫45 s，55℃保溫45 s，72℃保溫45 s，共32個循環，最后在72℃保溫5 min。使用3%瓊脂糖凝膠電泳對結果進行半定量分析，并以數字凝膠記錄系統進行可視化。

用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌3組SW480細胞(SW480細胞組、放療組、β-欖香烯聯合卡鉑+放療組)并用裂解緩沖液(NaCl 150 mmol/L， Tris 50 mmol/L，1%脫氧膽酸鈉)裂解，加入十二烷基硫酸鈉、1% Triton X-100、乙二胺四乙酸酯5 mmol/L在冰上保持20 min，離心10 min。根據試劑盒提供方案，使用BCA蛋白定量分析試劑盒(BCA Protein Assay Kit)測定蛋白質水平。將等份的細胞裂解物試樣在10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠上電泳，再電轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉，在Tween 緩沖鹽水4℃下保持2 h。將膜與多克隆兔抗Caspase-3蛋白和小鼠Caspase-6蛋白抗體在4℃下過夜，然后用二級山羊抗兔IgG抗體在室溫下保持2 h。化學發光試劑盒檢測Caspase-3、Caspase-6蛋白的表達水平，β-肌動蛋白作為內部參考。

2 結 果

2.1 各組SW480細胞OD值、存活率比較 與SW480細胞組比較，放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯合卡鉑+放療組細胞SW480細胞OD值、存活率水平均降低(P<0.05)；與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，β-欖香烯聯合卡鉑+放療組SW480細胞OD值、存活率水平降低(P<0.05)；放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，SW480細胞OD值、存活率水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組SW480細胞OD值、存活率比較

注：與SW480細胞組比較，aP<0.05；與放療組比較，bP<0.05；與β-欖香烯組比較，cP<0.05；與卡鉑組比較，dP<0.05

2.2 各組SW480細胞克隆形成數目比較 與SW480細胞組比較，放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯合卡鉑+放療組細胞克隆形成數目降低(P<0.05)；與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，β-欖香烯聯合卡鉑+放療組細胞克隆形成數目降低(P<0.05)；放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，SW480細胞克隆形成數目差異無統計學意義(P>0.05)，見表2及圖1(封3)。

表2 各組SW480細胞克隆形成數目的比較個)

注：與SW480細胞組比較，aP<0.05；與放療組比較，bP<0.05；與β-欖香烯組比較，cP<0.05；與卡鉑組比較，dP<0.05

2.3 各組SW480細胞凋亡率、G1期比例比較 與SW480細胞組比較，放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯合卡鉑+放療組凋亡率、G1期比例升高(P<0.05)；與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，β-欖香烯聯合卡鉑+放療組凋亡率、G1期比例升高(P<0.05)；放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，SW480細胞凋亡率、G1期比例差異無統計學意義(P>0.05)，見表3及圖2(封3)。

表3 各組SW480細胞凋亡率、G1期比例的
表達比較

組 別復孔數凋亡率G1期SW480細胞組63.10±0.3466.38±0.95放療組64.65±0.21a68.66±1.08aβ-欖香烯組64.71±0.26a69.05±1.03a卡鉑組64.69±0.25a69.01±1.05aβ-欖香烯聯合卡鉑+放療組68.22±0.38abcd75.32±0.84abcdF值15.65418.598P值0.0000.000

注：與SW480細胞組比較，aP<0.05；與放療組比較，bP<0.05；與β-欖香烯組比較，cP<0.05；與卡鉑組比較，dP<0.05

2.4 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達水平比較 與SW480細胞組比較，放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達升高(P<0.05)；與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，β-欖香烯聯合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達升高(P<0.05)；放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA
表達水平比較

組 別復孔數Caspase-3 mRNACaspase-6 mRNASW480細胞組60.89±0.290.87±0.29放療組61.91±0.17a2.08±0.17aβ-欖香烯組61.93±0.19a2.11±0.18a卡鉑組61.92±0.20a2.03±0.21aβ-欖香烯聯合卡鉑+放療組63.59±0.28abcd4.21±0.29abcdF值19.98725.654P值0.0000.000

注：與SW480細胞組比較，aP<0.05；與放療組比較，bP<0.05；與β-欖香烯組比較，cP<0.05；與卡鉑組比較，dP<0.05

2.5 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較 與SW480細胞組比較，放療組、β-欖香烯組、卡鉑組、β-欖香烯聯合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6蛋白表達升高(P<0.05)；與放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，β-欖香烯聯合卡鉑+放療組Caspase-3、Caspase-6蛋白表達升高(P<0.05)；放療組、β-欖香烯組、卡鉑組比較，SW480細胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表5及圖3。

表5 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6
蛋白表達水平比較

組 別復孔數Caspase-3/β-actinCaspase-6/β-actinSW480細胞組61.65±0.540.96±0.54放療組62.98±0.87a3.54±0.54aβ-欖香烯組63.01±0.98a3.51±0.65a卡鉑組63.02±0.94a3.58±0.78aβ-欖香烯聯合卡鉑+放療組64.99±0.86abcd5.65±0.49abcdF值32.36526.987P值0.0000.000

注：與SW480細胞組比較，aP<0.05；與放療組比較，bP<0.05；與β-欖香烯組比較，cP<0.05；與卡鉑組比較，dP<0.05

注：A.SW480細胞組；B.放療組；C.β-欖香烯組；D.卡鉑組；E.β-欖香烯聯合卡鉑+放療組

圖3 各組SW480細胞Caspase-3、Caspase-6蛋白表達水平比較

3 討 論

放射治療是結腸癌的一種重要治療方式，特別是局部晚期腫瘤，可誘導腫瘤細胞死亡，在不影響病變周圍重要器官(例如正常肝組織、小腸和腎)的情況下，難以實現腫瘤自由基輻射劑量。因此，任何在沒有劑量遞增的情況下增加輻射治療功效的化合物(即在較低劑量下的較高治療反應)將對癌癥治療有益。因此，對這種生物反應調節劑的研究是癌癥治療中的主要要求。β-欖香烯對人類癌細胞具有細胞毒活性。研究發現，β-欖香烯通過引起細胞色素P450生物活化誘導MCF7乳腺癌細胞的抗癌活性；β-欖香烯可誘導人肺癌A549細胞G1/S期阻滯和細胞凋亡；β-欖香烯在實驗小鼠中具有放射增敏特性，并通過活性氧(ROS)的產生誘導宮頸癌細胞凋亡[11-14]。本結果與上述討論符合，同時提示β-欖香烯聯合卡鉑能增加結腸癌SW480細胞放療敏感性，抑制結腸癌SW480細胞增殖、侵襲水平，促進腸癌SW480細胞凋亡水平。

半胱天冬酶是由15個成員組成的半胱氨酸蛋白酶家族，在程序性細胞死亡和炎性反應中起著重要作用。其中，Caspase-3、Caspase-6是一種典型的凋亡執行者，被啟動子Caspase-8或Caspase-9激活后，切割細胞內其他功能關鍵的蛋白質，導致細胞凋亡。許多抗癌療法，包括細胞毒性藥物、放射療法或免疫療法都可以通過激活Caspase-3來導致腫瘤細胞死亡。因此，許多研究人員使用Caspase-3激活作為癌癥治療功效的替代標志物[15-16]。增加的Caspase-3、Caspase-6活性通常被認為是細胞凋亡的標志，并且是癌癥治療療效的陽性指標。最近，有越來越多的證據表明，Caspase-3、Caspase-6可抑制應激誘導的癌細胞生長、細胞遷移、侵襲和腫瘤血管生成[17]。在人類癌癥治療中，一些研究報道了proCaspase-3、Caspase-6水平較高或活躍的患者預后高于proCaspase-3、Caspase-6水平較低的患者。最近的一項研究表明，Caspase-3、Caspase-6作為腫瘤抑制因子，在細胞暴露于化學物質和輻射后具有抑癌作用。Caspase-3、Caspase-6通過旁分泌信號通路參與抑制腫瘤再生；Caspase-3、Caspase-6通過抑制血管生成微環境來抑制腫瘤生長[18]；此外，高表達Caspase-3、Caspase-6的膀胱癌細胞化療后其腫瘤抑制效果更佳。本結果提示β-欖香烯聯合卡鉑能促進SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA、蛋白表達，增加結腸癌SW480細胞放療敏感性。

綜上所述，β-欖香烯聯合卡鉑能增加結腸癌SW480細胞放療敏感性，抑制結腸癌SW480細胞增殖、侵襲水平，促進結腸癌SW480細胞凋亡水平；其機制與β-欖香烯聯合卡鉑能促進SW480細胞Caspase-3、Caspase-6 mRNA、蛋白高表達有關。