p16異常甲基化聯合高危人乳頭瘤病毒檢測在早期宮頸癌診斷中的臨床價值

鮑統惠，郭桂蘭，李武芬，祁璘

宮頸癌是臨床上最為常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率極高，僅次于乳腺癌，位居第2位，多見于發展中國家的中老年女性，但是隨著社會的發展及人們生活水平的提高，宮頸癌的發生正趨于年輕化并有明顯上升趨勢[1]。調查顯示，全球每年大約有48萬女性被確診為宮頸癌，有大約25萬的宮頸癌患者死亡[2]。宮頸癌患者的預后與其臨床分期存在很大的關系，在美國，宮頸癌患者從確診以后計算，5年的病死率大約為30%，如果患者能夠被早期確診，病死率可降低20%[3]。另外由于宮頸癌的發展是一個長期量變產生質變的過程，前期病變也是可以逆轉的，所以宮頸癌的早期診斷在降低病死率、提高生存率方面有著重要的意義[4]。目前，臨床上已公認高危人乳頭瘤病毒(HPV)的持續性感染是宮頸癌癌前病變及進一步惡化的關鍵，但是高危HPV感染并不一定能夠促使形成宮頸癌[5]。有研究顯示，機體抑癌基因表達的失活通常是通過相關基因啟動子區的異常甲基化引起的，在腫瘤發展的整個過程中，甲基化是早期發生的事件，可作為一種新型的腫瘤分子標志物[6]。現分析p16異常甲基化聯合高危HPV檢測在早期宮頸癌診斷中的價值，為其臨床診斷提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年3月—2019年3月在青海大學附屬醫院婦科行門診活檢、子宮全切術及宮頸環形電刀切除術患者100例(病例組)作為研究對象，根據其宮頸上皮是否存在異性細胞、細胞核分裂相、極性及異型細胞侵犯上皮細胞的程度分為宮頸癌亞組20例，年齡31～75(45.32±6.27)歲，按照我國2016年FIGO規定的的臨床分期[7]，Ⅰ期3例，Ⅱ期7例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例；高度病變亞組(CINⅡ～Ⅲ期)35例，年齡30～74(44.98±6.17)歲；低度病變亞組45例，年齡31～74(45.20±6.41)歲。另取正常人宮頸組織30例作為健康對照組，年齡31～73(44.53±6.39)歲。4組受試者年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①所有患者均為已婚女性，存在完整的宮頸；②均同意行宮頸癌活性病理檢查；③臨床資料完整。(2)排除標準：①心肝腎等功能障礙、精神障礙及并發有其他腫瘤疾病者；②長時間使用激素及免疫制劑者；③已接受生物、化療及放療者；④嚴重感染及自身免疫病史者；⑤已有顯著的宮頸癌臨床癥狀者；⑥依從性差，中途退出者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 p16異常甲基化檢測[8]：提取所有受試者宮頸組織的DNA，之后對其進行甲基化處理：①取宮頸組織的DNA 1～2 μg ，加入20 μl生理鹽水，再加入NaOH溶液3 mol/L調節濃度至0.3 mol/L，置于37℃條件下15 min；②加入新配濃度為10 mmol/L氫醌溶液調節濃度至5 mmol/L，再加入濃度為3.6 mol/L新配置的亞硫酸氫鈉調整為3.1 mol/L的最終濃度，最后加入礦物油，置于50℃條件下16 h；③再向上述樣品中加入適量3 mol/L NaOH溶液調節濃度至0.3 mol/L，置于37℃條件下15 min；④加入濃度為20 μg/μl糖原1 μl，加入濃度為8 mol/L醋酸氨溶液，調節樣品溶度為3 mol/L，按照樣品體積，加入2.5倍量的無水乙醇，-20℃條件下過夜。之后再通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)。陽性對照選用Sssl甲基轉移酶修飾的胎盤DNA，操作方法嚴格按照說明書執行。亞硫酸氫鹽修飾完全判斷：同一DNA在修飾前后均用非甲基化特異性引物和甲基化特異性引物擴增，即如果修飾前無目的條帶發生擴增現象，而修飾后存在目的條帶擴增現象，則為修飾完全。相關引物由賽百盛基因技術有限公司合成，見表1。

表1 MSP引物序列

注:U為非甲基化特異性內側引物;M為甲基化特異性內側引物

1.3.2 宮頸組織p16蛋白表達檢測[9]：采用Western-blot法檢測。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將提取處理后的蛋白質樣品向樣品孔中點樣30 μg，之后按照電泳操作方法進行電泳。再進行轉膜處理，在裝有蛋白的PVDF膜朝上，加入5%的封閉液，在4℃條件下搖床封閉3 h。之后加入兔抗人p16單克隆抗體(1 ∶1 000，購自Abcam公司)，為一抗，在4℃條件下孵育過夜，TBST進行洗滌操作，共3次，每次15 min。之后再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1 ∶1 000，購于上海信裕生物技術有限公司)，為二抗。在37℃條件下，孵育1 h，TBST進行洗滌操作，共3次，每次15 min。將上述經過處理的PVDF膜浸入到發光工作液中，室溫條件下，孵育1 min，瀝干后顯影保存，之后通過Quantity One軟件對電泳條帶光密度值進行分析，將內參β-actin與目的條帶光密度值進行對比，計算得出p16蛋白表達的相對量。

1.3.3 高危HPV病毒載量檢測[10]：通過第二代雜交捕獲試驗(HC-Ⅱ人乳頭狀瘤病毒檢測技術)測定。醫生采集每例患者的宮頸細胞，做好標記；另外，患者自身采用dacron棉簽放入陰道6～7 cm深左右，靜止30 s后，轉動棉簽取出即可，放置于做好標記的試管中。通過堿性溶液破壞患者體內病毒，使DNA雙鏈裂解成單鏈；通過RNA探針可以與病毒單鏈特異性結合形成雜交復合物；再通過其特異性抗體將復合物粘合于微孔壁上；之后雜交復合物會與堿性磷酸酶的多個抗體相結合，放大信號；最后，由于底物于堿性磷酸酶結合會發光，通過判定其發光強弱可以判定堿性磷酸酶的含量，從而確定雜交復合物的含量。陽性判定標準：對于上述2組待檢樣品，其中任何1組發現檢出的雜交復合物含量≥1.0 pg/ml時即可判定為陽性感染。采用聚合酶鏈式反應反向點雜交法對高危HPV病毒載量進行檢測，試劑盒購自深圳亞能生物技術有限公司，操作方法嚴格按照說明書執行。

2 結 果

2.1 4組高危HPV及p16異常甲基化陽性率比較 高危HPV和p16異常甲基化的陽性率比較，宮頸癌亞組>高度病變亞組>低度病變亞組>健康對照組(P均<0.01)，見表2。

表2 4組受試者高危HPV及p16異常

2.2 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達量與宮頸病變程度的關系 隨著宮頸癌病變程度的不斷加重，其HPV病毒載量呈現增加趨勢，兩者呈正相關(r=0.692,P<0.01)。隨著宮頸癌病變程度的不斷加重，p16蛋白表達量也逐漸增加，兩者呈正相關(r=0.554,P<0.01)，見表3。

2.3 3種檢測方法診斷早期宮頸癌的ROC曲線分析 p16異常甲基化、高危HPV及p16異常甲基化+高危HPV的AUC分別為0.62、0.74、0.98；p16異常甲基化+高危HPV的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值及約登指數明顯高于單項檢查，見表4、圖1。

表3 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達量與宮頸病變程度的關系 [例(%)]

表4 3種診斷方法對早期宮頸癌的cut-off值、敏感度及特異度

圖1 p16異常甲基化、高危HPV及聯合診斷的ROC曲線分析

3 討 論

大量研究顯示，許多腫瘤細胞呈現特定區域的CpG島高甲基化和整體基因組低甲基化，另外也有研究認為抑癌基因失活的主要機制為啟動子高甲基化[11]。實際上，腫瘤發生的本質是抑癌基因的失活及癌基因的激活。p16基因主要位于人類第9號染色體短臂上，是一個可直接參與細胞周期調控的抑癌基因，與諸多癌癥的發生關系密切[12]。CyclinD1能與p16功能蛋白競爭性地結合CDK4/CDK6，會對pRb蛋白磷酸化產生抑制，促使pRb-E2F復合物中的E2F難以解離，對細胞DNA合成和G1期進入S期的啟動具有較好的阻止效果，負反饋調節細胞增殖周期，另外pRb-E2F復合物水平的升高也反饋性地對p16的表達產生抑制[13]。Tong等[14]研究顯示，p16基因失活與腫瘤的發生關系密切，p16基因的失活主要包括甲基化、突變及缺失。Stiasny等[15]認為諸如垂體瘤、鼻咽癌及肺癌等多種腫瘤發生主要與p16基因的異常甲基化有關。本研究正常人和宮頸癌患者p16基因甲基化率分別為0%和45%，也證實了宮頸癌的發生與p16基因甲基化有關。而隨著癌變程度的增加，p16異常甲基化越顯著，提示在宮頸癌發生之前已有p16基因啟動子發生了甲基化，并逐漸惡化，有利于對宮頸癌癌變級別進行預測，可作為一種新型的腫瘤分子標志物。與Ahmad等[16]的研究結果相符合。Yildirim等[17]研究顯示，正常宮頸組織中p16蛋白不表達，而在宮頸癌中呈現高表達，且與病變程度呈正相關，與本研究中結果相符。對此，臨床上有2種解釋[18]：(1)宮頸癌發生時，Rb基因失活致使功能性pRb蛋白缺失，解除機體對p16基因的抑制，升高p16蛋白的表達；(2)HPV16癌基因E7可誘導pRb蛋白降解或者失活，可通過pRb與p16之間的負反饋調節，誘導p16蛋白高水平表達。

宮頸癌患者宿主細胞中整合的高危HPV基因組，會持續性地對E6/E7癌基因進行表達，進而維持癌細胞的生長[19]。HPV E6/E7主要通過影響細胞周期中的Rb蛋白和調節因子P53發生致癌機制。E7與Rb蛋白相結合，會使pRb-E2F中的轉錄因子E2F釋放出來，影響G1/S的啟動，進而激活細胞周期，促使細胞非控制性增長[20]。E6可與P53蛋白特異性結合，使其喪失對細胞的負生成調節功能[21]。本研究結果顯示，高危HPV病毒載量與宮頸病變程度呈正相關，且各病變程度患者HPV陽性率與Tsakogiannis等[22]研究相符。而經過ROC曲線分析聯合診斷的價值最高，這主要是由于HPV E7和p16基因均作用于以pRb為中心的pRb-E2F通路，而p16在G1～S期增殖過程中起著重要的作用，p16基因的甲基化會促使上述通路無限制進行，形成腫瘤[23]。據研究，人類癌癥細胞中pRb與p16基因水平呈負相關，兩者共同參與癌癥通路的抑制，破壞上述兩種的任一基因，均會促使細胞發生異常增生，兩者同時缺失會引起選擇性壓力缺乏[24]。隨著研究的不斷深入，發現單一高危HPV感染通常不會直接引起細胞發生癌變。Celewicz等[25]研究發現不同級別病變的高危HPV陽性宮頸癌亞組中均出現一定程度的p16甲基化，且出現p16甲基化的細胞大部分病變較為嚴重，故p16甲基化可能是促使低病變向高病變發展的誘導因子。

綜上所述，p16異常甲基化聯合高危HPV檢測對早期宮頸癌具有較高的診斷價值，值得臨床推廣應用。