核受體Nur77基因缺失誘導再生肝細胞凋亡及肝損傷

詹 琪 繆 旋 聶玉強

廣州市第一人民醫院消化內科(廣州510180)

肝臟的再生能力是肝損傷后肝功能恢復正常的重要保障機制。小鼠的肝大部分切除術(partial hepatectomy，PHx)是研究肝再生的主要動物模型[1]，PHx術后肝內枯否細胞(kupffer cell，KC)被激活[2]，后者釋放大量炎癥因子誘導肝細胞進入增殖周期，啟動肝再生。

核受體Nur77是調控癌基因表達的重要轉錄因子，與細胞增殖和凋亡均密切相關[3]，在前列腺、胃及胰腺惡性腫瘤中均表達上調[4- 6]。然而我們的前期研究發現，Nur77基因缺失小鼠PHx術后早期肝再生的進程加速，同時Nur77的靶基因PAI-1的表達下調，提示Nur77及其下游基因對肝再生早期的促增殖信號通路起抑制作用[7]。本研究進一步深入探討Nur77及其下游通路對肝再生早期肝臟細胞增殖的調控機制，為研究肝再生過程中復雜精準的信號網絡提供更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性Nur77基因敲除(knockout, KO)C57BL/6小鼠(由加州大學Wan教授惠贈)及野生型(wild type, WT)對照，均為12～14周齡，體質量范圍18.6～24.1 g，其中WT組(21.2±1.21)g，KO組(20.9±1.01)g，兩組小鼠體質量無差異。各組設PHx術后1 h、3 h、8 h、24 h、36 h、48 h和72 h，每個時間點5只小鼠，每組共35只小鼠[8]。本研究涉及的與動物實驗相關的內容與程序經華南理工大學實驗動物中心倫理委員會審核，遵從實驗動物使用和管理的相關法律法規，保證實驗動物的福利，動物倫理學編號(2017005)。

1.2 實驗材料與試劑

TUNEL試劑盒購自Thermo Scientific 公司，real-time PCR Power SYBR@Green PCR Master Mix、cDNA試劑盒、均購自Life Technologies公司。Cleaved Caspase-3抗體、β-actin抗體等購自Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 PHx手術方法參考作者已發表文章[8]

1.3.2 Real-time PCR：取50 mg肝組織，用Trizol試劑提取總RNA，Bioanalyzer 2100測定RNA濃度和純度。cDNA制備：用cDNA逆轉錄試劑盒(貨號4374967)，取1 μg總RNA按試劑盒說明書制備20 μL反應體系，反應條件為25℃ 10min，37℃ 2 h，85℃5min，4℃長期保存。用Primer3web設計小鼠caspase-8基因引物序列。引物、cDNA與Power SYBR@Green Master Mix混合成20 μL反應體系，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)為內參基因，用2-ΔΔCt值法計算相對基因表達量。Ct值來自于3次獨立試驗的均值。

1.3.3 末端脫氧核苷轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)和血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測。 按In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red (德國Roche公司)說明書所示，細胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, Invitrogen,美國)。計數在熒光顯微鏡下呈紅色熒光的細胞核，最少5個高倍視野(40×)。血清在-20℃ 保存，使用Liquid ALT Reagent試劑盒測定血清ALT濃度。

1.3.4 Western-blot：肝組織勻漿(40 μg)用聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳分離并電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉抗原，與Cleaved Caspase-3單克隆抗體4℃搖床緩慢孵育過夜，洗滌液洗滌室溫10min 5次，與HRP標記的二抗4℃搖床緩慢孵育 1 h，洗滌液洗滌室溫10min 5次，BeyoECL Plus試劑盒顯影，并用Scion Image軟件量化蛋白條帶密度，以內參蛋白β-actin為參照計算Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

所有數據用EXCEL軟件進行處理分析；兩組凋亡細胞核計數、血清ALT濃度、定量PCR以及蛋白相對表達量結果比較用成組t檢驗，P<0.05 被認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Nur77基因敲除小鼠肝再生過程出現肝細胞壞死

PHx術后所有小鼠均存活至指定時間點，按各時間點處理小鼠，通過對兩組各時間點的肝組織蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin HE)染色并觀察，見圖1，KO組PHx術后各時間點均發現肝組織局灶性壞死。兩組發生肝壞死的例數統計見表1，KO組在PHx術后72小時內共有11只個體出現肝壞死，占比約30%，高于對照組。

表1肝大部分切除術后肝損傷發生率

兩組小鼠的血清ALT檢測結果顯示KO組術后48 h和72 h血清ALT水平高于對照組(466.3±202.4 vs 72.0±58.8，t=4.18,P=0.009;486.2±156.3 vs 63.0±0.3，t=6.06P=0.004)圖1B,提示KO組在肝再生過程中存在肝損傷。

圖1 PHx術后各時間點肝壞死情況注：A：小鼠肝組織HE染色(×40)補充放大倍數；B：#：P < 0.01

2.2 Nur77基因缺失誘導再生肝細胞凋亡

為進一步闡釋Nur77對誘導KO組肝再生過程中發生肝壞死的分子機制，作者用TUNEL試劑盒對肝組織進行凋亡特異性染色。見圖2， KO組術后3 h和48 h肝組織內凋亡細胞核計數高于對照組(38.7±9.6 vs 2.8±0.2，t=8.23,P=0.001；87.3±19.4 vs 8.4±3.1，t=8.96,P=0.001)。提示Nur77缺失導致小鼠肝再生過程發生細胞凋亡。

圖2 PHx術后3小時、48小時肝細胞凋亡情況注：A：凋亡細胞經DAP-I染色后鏡下呈亮紅色；B：計數5個高倍視野(×60)內凋亡細胞數；C：PHx術后各時間點小鼠肝內caspase8基因mRNA；D：剪切的caspase3蛋白水平。#：P<0.05；##：P<0.001。

兩組肝組織中凋亡基因caspase-8的mRNA水平見圖2 C所示，PHx術后1、3、8、24 h KO組caspase-8基因的mRNA水平高于對照組(2.68±0.53 vs 1.88±0.18,t=3.19，P=0.012；5.16±0.85 vs 1.98±0.25,t=8.08，P<0.01；4.34±0.43 vs 2.24±0.47，t=7.38，P<0.01；2.46±0.49 vs 1.35±0.26，t=4.11，P<0.01)。剪切的caspase-3蛋白水平用來衡量組織中細胞凋亡的程度，我們用蛋白免疫印跡檢測再生肝組織中剪切caspase-3蛋白表達量，見圖2D，PHx術后3、8、24、48 h KO組肝內剪切caspase-3蛋白高于對照組(10.35±3.95 vs 2.34±1.20,t=4.33，P=0.008；7.24±2.47 vs 0.51±0.20，t=6.02，P=0.003；13.04±4.77 vs 3.39±2.03,t=4.16，P=0.007；13.56±5.56 vs 0.60±0.57，t=5.19，P=0.006)，提示KO組肝臟再生過程中發生肝細胞凋亡。

3 討 論

肝臟具有強大的再生能力，發揮并放大肝臟的再生能力，能最大限度的提高肝臟切除術后或者急性肝衰竭患者的存活率[9]。肝再生的早期階段是一個“肝臟免疫細胞活化——炎癥因子釋放——免疫再激活”的級聯放大的炎癥反應過程[10- 12]。然而大量活化的免疫細胞和炎癥因子在調控肝細胞進入增殖周期的同時又能夠避免對肝組織的炎癥損傷，需要有一種“選擇機制”精準的切換增殖與死亡相關信號通路的激活。

我們在研究Nur77對肝再生調控機制的過程中發現：該基因的缺失導致肝再生早期進程加速，且肝細胞提前進入分裂周期，提示Nur77可能通過其下游信號通路抑制肝再生的細胞增殖[8]。然而我們進一步研究發現，KO組30%的小鼠發生組織壞死及肝損傷，進一步凋亡特異性染色發現KO組肝組織中凋亡細胞數量顯著增加，提示Nur77基因缺失誘導小鼠再生肝臟凋亡及肝損傷。Nur77基因敲除小鼠肝臟再生過程中這種“細胞損傷”與“細胞增殖”并存的現象說明Nur77可能是肝再生過程中維持“炎癥損傷-細胞增殖”穩態的關鍵因子，因此我們假設Nur77通過調控肝再生早期炎癥因子信號通路的下游基因表達，并通過其核-漿轉運機制實現細胞增殖或者凋亡的效應[13- 14]。

Nur77的核-漿轉運與凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的表達與活化密切相關[15- 17]，為了進一步驗證Nur77缺失誘導小鼠再生肝臟凋亡的分子機制，我們分別從mRNA和蛋白水平檢測肝再生進程中肝細胞的凋亡過程。結果顯示KO組肝臟在PHx術后3小時，凋亡基因caspase-8及剪切的caspase-3蛋白水平即顯著上調并持續至術后48小時。這一結果與組織學及血清學改變相一致，后者于術后48至72小時達峰值。然而實驗中肝損害與細胞凋亡并非完全一致，部分肝損害個體出現在術后1至3小時，此時肝臟凋亡基因表達開始上調，提示肝細胞凋亡繼發于肝損害。肝內KC細胞的激活是肝再生啟動的關鍵機制[18- 19]，PHx術后門靜脈內快速增多的脂多糖(LPS)誘導腫瘤壞死因子α(TNFα)上調，后者激活肝內KC細胞，活化的KC細胞釋放大量炎癥介質誘導肝細胞增殖,而Nur77缺失與巨噬細胞的過度激活密切相關[20]，進而導致再生肝臟出現炎癥損傷。

綜上所述，核受體Nur77可能是調控肝再生過程中“增殖-凋亡”穩態的重要調控因子，進一步研究將有助于闡釋調控肝再生這一精準且復雜過程的信號網絡。