加味甘麥大棗湯對慢性應激抑郁模型小鼠行為的影響

閆一民 張 璐 戴佳婕 肖 楓 唐順兒 羅宇齡 劉烜彬 伍璟瑜常 樂 賴文靜 苗婉菁 陳盛強 鐘 成

1 廣州醫科大學(廣州511436)2 廣州醫科大學附屬第二醫院 (廣州 510260)

抑郁癥(depression)是情感性精神障礙(mood-disorders)的主要類型,主要特征是顯著而持久的心境低落。隨著社會發展、生活節奏加快,社會環境及心理因素等各種應激因素的增加，抑郁癥發病率逐年攀升，已成為現代社會的常見病、高發病?，F代藥理學研究表明,抑郁癥的病因甚為復雜,誘發原因諸多,目前的抗抑郁藥主要基于腦內單胺類神經遞質去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)等研發而成。但西藥具有成本高、價格貴、副作用大等缺點，甚至部分患者服用后產生錐體外系反應，而部分有藥物不良反應。而中藥的治療效果逐漸被人們所發現，中醫中雖并無“抑郁癥”此病名,但郁證、失眠、臟躁癥狀與其相似,故全部歸于本病范疇。中醫理論認為, 抑郁癥是以“悲 ”和“愁”為突出的心境體驗,其病理機制在于心氣不足與肝氣不舒兩方面。根據中醫辨證施治的原則, 臨床上以疏肝理氣解郁為主,輔以養心安神、補益心脾、滋補肝腎等治法。藥物類型則多以理氣、祛痰、安神、開竅、補益心脾等為主。目前國內外對抑郁癥的治療，方法各異，但如何真正有效且少副作用地緩解抑郁癥患者的痛苦仍是當今醫學界面臨的一大難題。

甘麥大棗湯出自《金匱要略·婦婦人雜病脈證治》,由甘草三兩,小麥一升,大求十枚配制而成,具有補益心脾,寧心安神之功效,主治由情志不舒或思慮過度,肝化火,耗損陰液,心神失養所致的的臟躁[1]。本方被現代中醫廣泛用于抑郁癥的治療。據統計,以甘麥大棗湯治療抑郁癥占所有抑郁癥用方的比重為約14.84%,并取得了一定的療效[2- 3]。本研究主要探討慢性應激抑郁模型小鼠系統性應用加味甘麥大棗湯,在高架十字迷宮,曠場試驗, Morris水迷宮中抑郁小鼠行為恢復水平與正常型水平的差距。本研究為抑郁的治療提供了一種新的思路，為研發新的治療抑郁的藥物提供實驗依據，并為今后的臨床運用提供理論基礎和實驗方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材

①加味甘麥大棗湯(炙甘草,五味子,浮小麥15～30 g,大棗15～30 g,干地龍各6～10 g,僵蠶,黨參,煅龍骨各15～20 g,珍珠末(沖)2～4支,蟬蛻,制天麻各8～12 g,白術8～15 g,鉤藤10～15 g,茯神20～30 g,全蝎6～12 g)

②小鼠體質量稱量儀

③行為學器材：高架十字迷宮，Open field test, Morris水迷宮系統

④苦味酸染色劑

1.2 動物

所有實驗動物的操作及飼養均符合廣東省及廣州醫科大學實驗動物管理飼養條例，遵循動物倫理學原則。

由廣州醫科大學番禺校區動物中心提供小鼠14只，小鼠采用四周育齡，體質量在12～18 g的。適應飼養一周后，取小鼠隨機分用藥組5只、模型組5只及空白組4只雌雄單籠飼養，并采用苦味酸進行染色標記。

1.3 建造抑郁小鼠模型

①造模前記錄小鼠體質量。

②造模：將用藥組和模型組放入小鼠電擊箱，調節電壓至30 V。重復給予小鼠連續的不可預測和不可逃避的足底電擊[4]?？傠姄魰r長 30min?？瞻捉M不作任何電擊處理。

③每天電擊結束時，給予用藥組小鼠200 mL配制加味甘麥大棗湯代替飲用水，給予模型組和空白組等量生理鹽水，每天更換水和藥劑，持續到造模完成。

④第13天結束造模后記錄小鼠體質量。

1.4 行為學實驗

造模7天后，第8天進行高架十字迷宮實驗及曠場試驗，第9天進行水迷宮實驗，持續實驗6天，并記錄數據。

1.4.1 曠場：實驗由一個不透明敞箱組成，將占箱子底面九分之一的正方形區域作為中央區域，敞箱底部其他部分作為外周區。敞箱上方有攝像頭記錄小鼠的活動。將小鼠放置中央區域后，迅速撤開，觀察小鼠的活動并進行記錄。分別記錄中央區和外周區的活動時間和活動路程并記錄小鼠在中央和外周區停留的次數。每只小鼠的實驗時間為5min，每完成一次實驗之后要清理糞便等殘留物，并用酒精和紗布擦拭敞箱，以免動物的殘留氣味對下一次實驗造成影響。實驗在安靜和光線不變的條件下進行。實驗前，動物在測定房間中適應 10min 以上[5- 6]。

1.4.2 高架十字迷宮：高架十字迷宮主要通過利用動物對新異環境的探究特性及其對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態。實驗在統一條件的光線和環境下建立一個十字型高架，設置兩個方向的開臂和兩個方向的閉臂區，開臂區三面沒有遮擋，只有底部的高架；閉臂區除了頂部以外均用擋板進行遮擋。將四臂交匯的中心區設置為起點，將小鼠放在中心區，觀察小鼠進入開放臂和封閉壁的潛伏期、次數以及在兩壁滯留時間(進出臂標準應嚴格界定，以四肢全部入臂或兩只前爪出壁為準)，計算小鼠進入開臂次數和在開臂滯留時間分別占總次數(進入開臂和閉臂次數之和)和總時間(在開臂與閉臂滯留時間之和)的百分比，并用攝像頭記錄小鼠的活動軌跡。每只小鼠進行一次實驗，實驗進行5min，每次實驗后用酒精清洗實驗裝置以免氣味干擾[7]。

1.4.3 Morris水迷宮：通過非常多的應用,水迷官實驗在當代神經科學研究中占據了一個十分重要的位置[8]。本實驗涉及的水迷宮為 Morris水迷宮( Morris water maze,MWM)。在水迷宮實驗中,讓動物利用遠側暗示從起始位置游到水下隱匿平臺,用重復訓練來評估空間學習,當水下平臺被撤出時,用平臺象限偏愛來確定動物的參考記憶[9]。

將一個圓形不銹鋼水池裝水并假定等分為四個象限，目標象限中放置一個圓形隱形平臺；讓水池中水面高于平臺0.5 cm，水溫保持21℃～22℃；實驗期間保持水迷宮內外環境和光線始終不變，并且水迷宮周圍需要有一定的參照物讓小鼠進行記憶和學習，水迷宮上方有一個攝像頭自動記錄小鼠的活動行為。將小鼠從平臺所在象限的對角象限入水點放下，運用Smart軟件記錄小鼠規定2min時間內從入水點到找到爬上平臺(逃避潛伏期)的時間和路程。實驗進行1～4d的訓練學習,在此期間小鼠每天訓練兩個階段,每個訓練階段包括四次試驗。分別使小鼠隨機地從東西南北四個方向象限開始,每轉變一次方向讓小鼠休息10～15min。把小鼠從水池中移出之前必須讓小鼠在平臺上休息15s中。對于那些在120s內還沒有找到平臺的小鼠,試驗者要把小鼠放在平臺上,并且讓其在平臺上休息15s。然后再把它從水池中移出。兩個訓練階段之間要間隔90min，4～7d進行實驗，記錄小鼠的活動時間和活動路程，并記錄下小鼠活動的軌跡。[10- 13]

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 曠場結果

通過數據分析我們發現三個組在中央區活動距離、中央區活動速度、中央區活動時間、周圍區活動時間指標上并無差異，但是在周圍區活動距離、周圍區活動平均速度方面空白組和模型組、用藥組存在差異(見表1)。在平均值的對比下，空白組在中心區和周圍區的活動速度都高于另外兩個組，空白組的外圍區的活動時間和活動距離也是三組中最高。模型組在中央區的活動距離和中央區的活動時間都在三組中最高，說明模型組更多停留在初始周圍位置，缺乏探索性，情緒比較低落。

2.2 高架十字迷宮結果

通過數據分析，雖然我們發現在開閉臂的次數、路程、時間和相應的比值的單因素方差分析中并未發現差異(見表2)，但通過平均值數據的比較，我們發現空白組小鼠進入閉臂的次數和路程高于模型組和用藥組，同時空白組小鼠在開臂的停留時間三組中最長，而模型組的小鼠四腳進入開臂的次數最少，在閉臂的停留時間在三組中最長，活動范圍減少。用藥組小鼠四腳進入開臂的次數在三組中最高。

中央區活動距離/cm 中央區活動平均速度(cm/s)中央區活動時間/s周圍區活動距離/cm周圍區活動平均速度(cm/s)周圍區活動時間/s模型組1 925.60±713.4150.32±9.0239.96±16.996 332.08±969.8924.47±3.99259.76±16.85用藥組1 675.32±680.0750.13±8.9933.24±12.066 249.02±653.6023.52±3.09266.44±11.99空白組1 763.12±502.9857.23±17.8832.17±11.238 005.85±439.8929.99±2.13267.32±10.92 F0.1900.4800.4397.6554.9780.432P0.8290.6310.6560.0080.0290.660

進入閉臂次數/次閉臂滯留時間/s閉臂路程/cm模型組15.60±8.20168.62±52.722 253.03±508.18用藥組18.40±3.04165.0±48.032 644.30±184.52空白組19.25±4.71140.67±58.212 932.52±667.28F0.5020.3582.309P0.6180.7070.145

2.3 Morris水迷宮結果

通過分析數據我們發現：在定位航行實驗中速度的指標上，用藥組和空白組有差異(P=0.030)(見表3)；在原象限游泳時間與游泳總時間之比的指標上，用藥組、模型組和空白組之間不存在差異；在原象限游泳的距離與游泳總距離之比的指標上在單因素方差分析的事后多重比較上，模型組和用藥組依然存在差異。用藥組小鼠在第六天時，原象限游泳的距離與游泳總距離之比的平均值、在原象限游泳的時間與游泳總時間之比的平均值都較模型組較高。空白組小鼠較之模型組小鼠的原象限游泳的距離與游泳總距離之比的平均值、在原象限游泳的時間與游泳總時間之比的平均值也都較高。原象限游泳的距離與游泳總距離之比越大說明該組小鼠在原平臺所在象限游過的距離也就越長。原象限游泳的時間與游泳總時間之比越大也表明該組小鼠在原平臺所在象限花費的時間越多。

表3水迷宮第六天定位航行實驗測定指標值

3 討 論

從行為學表現來看，用藥組小鼠基本能力恢復到了正常水平，在曠場實驗中用藥組小鼠各指標水平則處在兩組之間，說明加味甘麥大棗湯一定程度上恢復了小鼠的自主探索能力和活躍程度。同時經過電擊等措施的小鼠出現明顯的抑郁表現，中央區活動速度減慢，周圍區活動距離減少，反映模型組和用藥組小鼠面對陌生環境的自主探索性和活躍程度減少，出現抑郁癥狀，說明抑郁小鼠模型構建成功。

高架十字迷宮試驗是利用動物對新異環境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態。小鼠由于嗜暗性會傾向于在閉臂中活動，但出于好奇心和探究性又會在開臂中活動，在面對新奇刺激時，動物同時產生探究的沖動與恐懼，這就造成了探究與回避的沖突行為，從而產生焦慮心理。在高架十字迷宮試驗中我們發現空白組小鼠進入閉臂的次數和路程高于模型組和用藥組，說明高空的開臂使小鼠發生了恐懼心理，同時空白組小鼠在開臂的停留時間三組中最長，說明三組中空白組的探索能力相對更高。而模型組的小鼠四腳進入開臂的次數最少，在閉臂的停留時間在三組中最長，說明模型組小鼠存在明顯抑郁，情緒低落的行為表現，缺乏對新奇刺激的探索性，活動范圍減少。用藥組小鼠四腳進入開臂的次數在三組中最高說明加味甘麥大棗湯緩解了抑郁小鼠的焦慮癥狀的行為表現，出現更多的探索性行為，進入開臂的次數增多，焦慮抑郁情緒也得到了緩解，嚴重程度降低。

水迷宮實驗主要是通過強迫小鼠游泳，使其尋找隱藏在水中的休息平臺，從而訓練小鼠進行空間定位和記憶，觀察小鼠的空間定位和學習記憶能力。在水迷宮實驗中用藥組和空白組的時間之比，距離之比都較之模型組高。說明用藥組和空白組學習記憶和空間定位表現更好，原象限游泳的距離與游泳總距離之比越大說明該組小鼠在原平臺所在象限游過的距離也就越長。原象限游泳的時間與游泳總時間之比越大也表明該組小鼠在原平臺所在象限花費的時間越多，在該象限的空間定位和探索更頻繁。綜上可知，加味甘麥大棗湯對小鼠抑郁癥的緩解起到了一定的作用，較有效的改善了抑郁的小鼠的空間定位和學習記憶能力，使其基本能力恢復與正常小鼠水平相當。

總的來說，模型小鼠的自主活動量減少、高空探索性能降低，同時學習記憶水平提高緩慢，抑郁情緒明顯，說明造模成功；沒有接受過任何刺激的空白組活動水平及學習能力接近野生小鼠水平；接受藥物治療的用藥組，自主活動量、高空探索性能以及學習記憶水平總體上介于模型組和用藥組之間。最后通過對比，用藥組活動幾乎接近正常水平，表明用藥組在口服加味甘麥大棗湯以后，確實緩解和改善了小鼠抑郁情緒，進而影響其行為水平。

但是我們的實驗仍存在繼續研究的可能比如藥物劑量大小及實驗觀察期長短，或者需要更長時間的用藥觀察期及大樣本觀察。抑郁癥疾患增長的現狀促使科學研究需要不斷前進，而要想取得更大的進步，需要不斷嘗試創新，從中藥入手也不失為尋找新方法的重要手段，加味甘麥大棗湯已經在臨床上用于治療抑郁癥，而我們實驗表明它同樣對抑郁小鼠的癥狀改善有一定的作用，為臨床上的使用提供了一定的實驗依據。雖然實驗有待進一步深入探究，但是目前基于小樣本量，能觀測到部分向上的趨勢，未來繼續深入研究探討，離探明加味甘麥大棗湯對改善抑郁的作用機制將會越來越近。