胃癌組織中HTRA1的表達水平及臨床意義

王騰，金琳芳，華東

無錫市第四人民醫院腫瘤內科，江蘇 無錫 214062

胃癌是消化系統常見的一種惡性腫瘤，早期胃癌缺乏特異性臨床表現，容易與胃潰瘍、胃炎等疾病混淆，具有較高的發病率和病死率，嚴重威脅著患者的生命安全[1]。盡管目前胃癌的綜合治療方案已不斷完善，但是患者的病死率仍未得到明顯改善，而復發、轉移是導致胃癌患者死亡的重要原因之一。相關研究表明，淋巴結轉移和TNM分期等病理特征均能夠一定程度反映腫瘤的進展情況，評估患者預后，但是目前臨床尚缺乏對胃癌高危人群篩選、診治的典型標志物[2]。細胞癌變是一個多因素及多階段過程；近年來研究發現，蛋白酶在細胞癌變過程中具有重要作用，其可以通過降解細胞外基質，參與細胞的遷移及侵襲過程[3]。絲氨酸蛋白酶1（high temperature requirement factor 1，HTRA1）廣泛表達于機體組織中；研究表明，HTRA1在宮頸癌等腫瘤中表達缺失或下調，提示其可能具有抑瘤作用[4]。Miyamoto等[5]研究發現，絲氨酸蛋白酶表達降低能夠影響卵巢癌患者對化療藥物的細胞毒性作用，引起細胞化療耐受。還有研究報道，HTRA1表達下調可能與腫瘤患者的不良預后有關[6]。但是，目前關于HTRA1與胃癌關系的系統研究尚缺乏，因而本研究探討了胃癌組織中HTRA1的表達情況及其臨床意義，旨在為胃癌的臨床診治提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年1月至2014年7月于無錫市第四人民醫院行根治性手術的胃癌患者。納入標準：①經臨床表現、血液腫瘤標志物檢測、影像學檢查、病理組織學檢查等確診為胃癌[7]；②術前未行放化療、靶向治療等抗腫瘤治療；③未合并其他部位惡性腫瘤；④病歷資料完整。排除標準：①合并嚴重肝腎功能不全；②胃癌復發患者。根據納入和排除標準，本研究共納入胃癌患者87例。其中，男52例，女35例；年齡41～72歲，平均（57.85±6.94）歲；腫瘤部位：幽門51例，胃體部25例，賁門11例；分化程度：低分化40例，中高分化47例；幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染陽性 31例，HP感染陰性 56例；浸潤深度：T1～229例，T3～458 例；腫瘤直徑：P＜5 cm 36例，≥5 cm 51例；有淋巴結轉移62例，無淋巴結轉移25例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ期69例。收集所有患者的胃癌組織和癌旁組織（距離腫瘤病灶5 cm以外的正常胃組織）標本，本研究經過醫院倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組織化學染色法檢測不同組織中HTRA1的表達情況

取胃癌患者的胃癌組織和癌旁組織，置于液氮中并轉移至-80℃低溫箱中保存待用。采用免疫組織化學染色法檢測不同組織中HTRA1的表達情況，石蠟標本進行4 μm層厚連續切片，放置70℃KD-PIII型生物組織攤烤片機（購自蘇州景通儀器有限公司）中烘烤1.5 h。將切片進行二甲苯脫蠟，并予以100%、90%、80%、70%的梯度乙醇水化。于蒸餾水中漂洗3 min，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗3次。于切片中加入3%H2O2去離子水孵育10 min，抑制內源性過氧化物酶活性。以PBS沖洗3次，予以熱抗原修復，PBS沖洗3次。于切片中加入適當比例稀釋小鼠抗人HTRA1單克隆抗體，放置于4℃冰箱中過夜。以PBS沖洗3次，加入通用性免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體，于室溫環境下放置30 min。以PBS沖洗3次，于每個切片中加入2滴剛配制的二氨基聯苯胺（diaminobenzine，DAB）溶液進行顯色，于CX-40顯微鏡（購自日本Olympus公司）下調控顯色時間至陽性物質出現棕黃色時，以自來水沖洗并終止顯色反應。取蘇木素進行復染，以自來水再次返藍，梯度乙醇以脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂進行封片。免疫組化染色具體步驟參照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶試劑盒說明書進行。

1.3 免疫組織化學染色法結果判定

HTRA1蛋白表達于細胞核中，陽性表達為細胞內出現棕褐色顆粒。采用雙評分半定量法對染色結果進行評價，依據染色強度進行評分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據陽性細胞所占比例進行評分：隨機選取每張切片的5個高倍鏡視野（×400），每個視野計數500個細胞，陽性細胞所占比例≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，≥76%計4分。將染色強度評分和陽性細胞所占比例評分的乘積作為最后評分，0分為陰性表達（-），1～4分為弱陽性表達（+），5～8分為中度陽性表達（++），9～12分為強陽性表達（+++）[8]，本研究將弱陽性、中度陽性和強陽性表達均歸為陽性表達。

1.4 隨訪

所有胃癌患者均以門診復診、電話等方式進行為期5年的隨訪，以2019年7月30日為截止日期，刪失值為研究對象因其他原因死亡或失訪，記錄隨訪期間患者的生存情況。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗；采用Cox風險比例回歸模型對胃癌根治術后患者預后的影響因素進行分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HTRA1表達情況的比較

胃癌組織中HTRA1蛋白的陽性表達率為16.1%（14/87），明顯低于癌旁組織的85.1%（74/87），差異有統計學意義（χ2=82.770，P＜0.01）。（表1）

表1 HTRA1在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況[n（%）]

2.2 胃癌組織中HTRA1表達與胃癌患者臨床特征的關系

不同性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、HP感染情況胃癌患者胃癌組織中HTRA1的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ期胃癌患者胃癌組織中HTRA1的陽性表達率分別低于浸潤深度為T1～2、腫瘤直徑＜5 cm、無淋巴結轉移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中HTRA1陽性表達情況的比較（n=87）

2.3 胃癌組織中HTRA1表達與胃癌患者預后的關系

截至隨訪結束，87例胃癌患者中，27例患者死亡。其中，14例HTRA1陽性患者中，1例患者死亡，平均生存時間為57（95%CI：56～60）個月；73例HTRA1陰性患者中，26例患者死亡，平均生存時間為 51（95%CI：48～54）個月；HTRA1 陽性胃癌患者的生存結局優于HTRA1陰性患者，差異有統計學意義（χ2=4.016，P=0.045）。（圖1）

2.4 胃癌根治術后患者預后影響因素的多因素分析

以隨訪結束時患者是否死亡為因變量（死亡=1、生存=0），以浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結轉移情況、TNM分期、HTRA1表達情況作為自變量，Cox比例風險回歸模型結果顯示，浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ期、HTRA1陰性是胃癌根治術后患者預后的獨立危險因素。（表3）

圖1 HTRA1陽性（n=14）和HTRA1陰性（n=73）表達胃癌患者的總生存曲線

表3 87例胃癌根治術后患者預后影響因素的多因素分析

3 討論

胃癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，具有較高的發病率和病死率，嚴重危及患者的生命安全，已成為重要的公共衛生問題[9-10]。了解胃癌的發病機制，從而對胃癌進行早期干預，對提高患者的療效，延長患者的生存期具有重要作用。近年來，隨著對胃癌分子生物學研究的不斷深入，研究發現，胃癌的發生與多種基因和信號通路有關[11]。

HTRA1屬于人絲氨酸蛋白酶家族成員，廣泛存在于動物、植物及微生物體內，可以參與細胞抵御熱休克、炎性反應、氧化性應激等生理病理過程[12]。已有研究發現，HTRA1可以參與腫瘤細胞的侵襲、遷移等過程，且其表達水平增高時可以明顯抑制腫瘤的生長[13]。相關研究表明，HTRA1表達下調能夠加快腫瘤細胞的增殖，促進腫瘤細胞的遷移[14]。近年來研究發現，HTRA1表達下調后能夠增強細胞外基質與細胞間連接的能力，促進細胞的重構[15]。陳歡等[16]研究報道，上皮-間質轉化可以促進腫瘤細胞轉移，導致腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性；抑制上皮-間質轉化能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。相關研究顯示，HTRA1表達下調所致乳腺癌進展，可能與其誘導腫瘤上皮-間質轉化有關，抑制HTRA1表達能夠促進間質細胞表型轉變，產生侵襲和轉移能力[17]。還有研究表明，下調HTRA1表達可以通過誘導轉化生長因子β表達，激活調控轉化生長因子β信號轉導通路，進而參與細胞的增殖和分化過程[18]。既往研究已證實，活化的HTRA1能夠通過絲氨酸蛋白酶依賴方式促進腫瘤細胞的凋亡，而下調HTRA1表達能夠減少細胞毒性作用，導致腫瘤細胞化療耐受[19]。Zhao等[20]研究表明，HTRA1在對順鉑耐受的肺癌細胞中呈低表達。HTRA1在子宮內膜癌、黑色素瘤等多種腫瘤組織中表達下調或缺失，且腫瘤進展患者的HTRA1下調更為明顯，提示HTRA1下調與腫瘤進展有一定相關性[21]。本研究結果顯示，胃癌組織中HTRA1蛋白的陽性表達率明顯低于癌旁組織（P＜0.01），表明HTRA1表達可能與胃癌的發生有關。

既往研究顯示，HRTA1和腫瘤生物學行為有關[22]。本研究結果顯示，浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ期胃癌患者胃癌組織中HTRA1陽性表達率分別低于浸潤深度為T1～2、腫瘤直徑＜5 cm、無淋巴結轉移、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者（P＜0.05），提示隨著腫瘤惡性程度的上升，HRTA1的表達有所下調。Miyamoto等[5]研究發現，HTRA1表達水平降低與惡性腫瘤患者的總生存情況有關。本研究結果顯示，HTRA1陽性胃癌患者的生存結局優于HTRA1陰性表達患者，提示HRTA1可能與胃癌患者的生存預后有關，考慮與HTRA1在胃癌細胞中表達增強，可以促進胃癌細胞凋亡，及抑制胃癌細胞增殖有關。本研究結果還顯示，浸潤深度為T3～4、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ期是胃癌根治術后患者預后的獨立危險因素，提示HRTA1在胃癌組織中的表達與胃癌患者的多種生物學行為可能有關，可作為胃癌患者預后的預測指標之一。

綜上所述，胃癌組織中HTRA1的陽性表達率較低，且其表達水平與胃癌患者的浸潤深度、腫瘤直徑、淋巴結轉移和TNM分期有關，可作為胃癌患者預后預測的參考指標，在臨床具有較高的應用價值。但是本研究的樣本量少，因而有待更多樣本量的深入研究，以減少隨機誤差，增加結論的可靠性。