非洲豬瘟疫苗研究趨勢

陳江華 陳文智 梁旺旺 豐志華

（福建師范大學南方生物醫學研究中心，福建省天然免疫生物學重點實驗室 福州 350117）

非洲豬瘟病毒（ASFV）是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬唯一成員，是唯一的蟲媒雙鏈DNA病毒[1-2]，鈍緣蜱屬的節肢類動物為ASFV自然宿主和傳播媒介[3-4]。自然宿主感染該病毒后無并發癥，隨后發展為持續性感染[5]，家豬自然條件下感染ASFV后經過3～5 d的潛伏期，開始出現臨床癥狀，10～14 d內死亡，死亡率可達100%[6-7]。ASFV成熟病毒顆粒具有多層結構，直徑約200 nm，其衣殼為二十面體對稱結構，基因組大小為170～193 kb，有150～167個開放閱讀框，可編碼54種結構蛋白、100多種非結構蛋白，基因組差異主要源于多基因家族（MGFs）成員的拷貝數不同[8-11]。按其mRNA的累積動力學分析，ASFV基因可分為立早期基因、早期基因、中期基因及晚期基因；中期基因的存在說明其基因表達受到嚴密調控[12-13]。ASFV編碼的多種蛋白可抑制干擾素的表達，參與病毒免疫逃逸過程，但大多數蛋白功能未知[14]。目前認為ASFV主要通過巨胞飲及網格蛋白介導的胞吞作用侵染宿主單核巨噬細胞系統，但介導病毒與細胞相結合的受體還未發現[15-16]。

1921年ASF首次在肯尼亞報道[17]，疫情于2007年傳入俄羅斯等地區，隨后傳入烏克蘭（2012年）、白俄羅斯（2013 年）、立陶宛（2014 年）、羅馬尼亞（2017年）、匈牙利及中國（2018）[7,18]。ASFV 可分為 24 種基因型、8種血清型[18-19]，撒哈拉以南非洲地區存在所有基因型，只有基因型Ⅰ和基因型Ⅱ傳播到非洲以外地區[20]。ASFV基因型Ⅰ在1957年和1960年傳播到伊比利亞半島，后來侵入其他一些歐洲國家、加勒比地區和巴西，并仍留在撒丁島?；蛐廷蛟?007年從東非傳播到高加索地區，然后迅速傳播并在整個俄羅斯聯邦和東歐的一些國家蔓延[20]。不同毒株之間毒力存在著差異，中國首次發現與分離的ASFV為基因型Ⅱ型、血清型8型[18-21]。Ⅱ型ASFV具有高毒力并誘導產生急性ASF病癥，致死率接近100%[7,22-23]。目前，ASF有全球蔓延之勢，針對ASF沒有商品化疫苗，對于疫情只能被動防控（撲殺），不能主動預防，其對豬養殖業是災難性的，給豬養殖業帶來了巨大的經濟損失，因此，研發用于預防ASF的疫苗迫在眉睫。近年來隨著基因編輯技術與DNA測序及合成技術的發展，加快了非洲豬瘟疫苗研發的進程，研發針對預防非洲豬瘟的疫苗有滅活苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒載體疫苗等?，F對ASF疫苗研究的最新進展進行綜述，以期對ASF疫苗的研發提供參考。

1 滅活疫苗及弱毒活疫苗

早期研究主要聚焦于滅活疫苗的研制，FORMAN等[24]用戊二醛與洗滌劑分別處理ASFV侵染后的豬肺泡巨噬細胞并用于免疫，攻毒后發現戊二醛處理組有更快的血清學反應及病毒血癥有所減輕，洗滌劑處理組未觀察到明顯的血清學反應且針對同源病毒的攻擊也不具有保護作用。STONE等[25]用乙酰氮丙啶和縮水甘油醛處理制備的ASF滅活疫苗免疫后可產生抗體，但不能抵御ASFV的攻擊。新型佐劑也未能增強滅活疫苗的保護效果，BLOME等[26]分別用佐劑PolygenTM與配伍滅活的ASFV亞美尼亞08株免疫小豬，免疫后小豬可產生特異性抗體，但用同源毒株攻擊，發現該滅活疫苗免疫后并不能提供保護作用，且免疫組攻毒后更早出現臨床癥狀。目前，滅活苗的研制都以失敗告終，關于ASF滅活疫苗的研究也較少報道。

大多數病毒經過多次細胞傳代可致弱，ASFV也不例外。MANSO等[27]將細胞傳代致弱的病毒接種家豬后并未引起家豬死亡，且可抵御強毒攻擊。隨后進行免疫接種，但接種后約有23%的豬出現了臨床癥狀以及部分豬出現死亡。TITOV等[28]用經細胞傳代致弱獲得的KK262株免疫小豬后再用同源毒株K49株（基因型Ⅰ，血清型2）攻擊，發現免疫后小豬并不能抵御野生型K49株的攻擊?？梢姡浖毎麄鞔氯醯腁SFV毒力不穩定，接種后易反強或免疫原性差，強毒攻擊后最終導致慢性感染及死亡。但相關研究表明弱毒活疫苗仍可抵御強毒攻擊，如OURT88/3 株[29-30]。KING 等[30]用 OURT88/3 株免疫小豬后再用強毒株OURT88/1加強免疫，最后用強毒株烏干達1965分離株（基因型X）及Benin 97/1（基因型Ⅰ）攻擊，發現OURT88/3株免疫后可抵御強毒株OURT88/1、烏干達1965分離株及Benin 97/1的攻擊。通過測序發現OURT88/3株與強毒株對比缺失了約10 kb的基因序列，該序列的丟失導致多基因家族（MGF360、MGF505、MGF530）大多數基因 缺失，這些基因與ASFV免疫逃逸相關，該片段缺失加強了Ⅰ型干擾素的反應強度[31-33]。O'DONNELL等[34-35]將多基因家族MGF360與MGF505的MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L、MGF505-2R以及 MGF505-3R刪除后獲得ASFV-G ΔMGF株，用該毒株免疫小豬后以強毒株ASFV-G攻擊顯示ASFV-GΔMGF株具有良好的保護能力；但在ASFV-G-△MGF基礎上再刪除9GL后獲得的ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF疫苗株不具保護作用。CRISPR/Cas9基因編輯技術是弱毒活疫苗研發的關鍵技術，其應用加快了ASFV弱毒疫苗的研發進程，BORCA等通過該技術構建了ASFV弱毒株（ASFV-G/Δ8-DR），但未進行免疫攻擊試驗。其他弱毒株有 ASFV-G-Δ9GL/ΔUK、Benin ΔDP148R、Pret4 Δ9GL、NHV/P68、OURT88/3 ΔDP2 及 Ba71 ΔCD2v、ASFV-GΔ9GL/ΔNL/ΔUK 等[34-51]，不同弱毒株之間其保護能力也各不相同，除了與所缺失基因不同外還與基因型相關（見表1）。目前，弱毒活疫苗仍是研究熱點與重點，國內已構建MGF360-MGF505R缺失弱毒株及MGF360-MGF505R與CD2v基因缺失弱毒株（原始毒株Pig/HLJ/18[21]）但未見詳細報道。

2 亞單位疫苗及核酸疫苗

非洲豬瘟病毒 p12、p30、p54、p72、CD2v 等結構蛋白為亞單位疫苗以及核酸疫苗研究的熱點[52-58]（見表2），這些亞單位疫苗及核酸疫苗可誘發機體產生免疫應答，但大多數疫苗并不能提供很好的保護，且有些疫苗保護效果還有待驗證。LACASTA等[56]將p30、p54及血凝素胞外結構域與泛素融合表達構建的核酸疫苗免疫小豬后，保護率為33%。隨后LACASTA等構建表達除p30、p54及血凝素在內的ASFV所有ORF的質粒（4 029個）并用于免疫攻擊試驗，保護率為60%且觀察到25%（2/8）的小豬在任何階段無排毒現象，但這是否由疫苗免疫導致還有待驗證。有研究表明，攻毒后存活小豬不排毒并不是疫苗免疫導致，而是ASFV不能在幸存豬中長期潛伏及排毒[23]。SUN-YOUNG等[57]用表達CD2v、p72、p32、±p17 的質粒以及重組蛋白 p15、p35、p54、±p17免疫小豬后可產生特異性抗體，但以強毒株亞美尼亞2007株進行攻擊后發現，相比對照組免疫組小豬在攻毒后出現更早的臨床癥狀、病毒血癥及死亡，表明核酸疫苗及亞單位疫苗免疫后產生的特異性抗體并不能中和病毒且增強了ASFV的感染，提示在核酸疫苗及亞單位疫苗研究中選擇更多的抗原免疫并不一定能取得更好的效果，選擇合適的抗原組合是關鍵。由于ASFV結構蛋白眾多，單靠幾種結構蛋白免疫機體難以提供較為全面的保護。因此，表達ASFV蛋白所制備的亞單位疫苗或者可表達幾種蛋白組合的核酸疫苗及重組疫苗的研究有待進一步探索。

表1 ASFV弱毒活疫苗

3 病毒載體疫苗及復制缺陷型疫苗

腺病毒與痘病毒常被作為載體將外源基因遞送到機體表達相關蛋白，使機體產生免疫反應用于抵抗病毒的入侵[59-62]。LOKHANDWALA等[61,63]將ASFV的多種基因經腺病毒載體導入機體表達 （見表3），以 “雞尾酒”式免疫可誘發機體產生較強的免疫反應，因此，其猜測通過腺病毒將ASFV相關基因遞送到機體產生免疫反應能有效抵抗ASFV的侵染。但其作為疫苗的有效性還需進行免疫攻擊試驗加以驗證。 LOPERAMADRID 等[62]以重組 B646L（P72）、EP153R和EP402R（CD2v）的痘苗病毒為載體免疫小豬，并不能誘導抗體應答但能誘發IFNγ的表達。研究表明，細胞免疫應答在ASFV免疫保護中扮演重要角色，CD8+T細胞的耗竭消除了OURT88/3株免疫后提供的保護作用[64]。NETHERTON C L等[65]篩選出能被T細胞識別并可激活細胞免疫的抗原蛋白 由 B646L、MGF110-5L、CP204L、CP530R、I73R、I215L、A151R、C129R、E146L 等基因 （來自 ASFV OURT88/3株）編碼，隨后將這些基因插入到腺病毒載體與牛痘病毒載體中進行免疫，發現免疫后可激活細胞免疫及體液免疫，但用強毒株OURT88/1攻擊后并未顯示這些病毒載體疫苗具有保護作用，僅降低部分免疫豬病毒血癥。CHEN X等[66]將ASFV p72基因通過反向遺傳學技術插入到新城疫病毒基因組中構建了rNDV/p72重組毒株，用該毒株免疫小鼠后可產生特異性抗體并引起T細胞增殖和IFN-γ、IL-4的分泌，其認為該毒株可作為預防ASFV的候選疫苗株，但未進行免疫攻擊試驗，其保護效果還有待確定?？梢姴《据d體疫苗激活免疫應答的能力因其攜帶的基因不同而存在差異，且大多數疫苗保護效果還有待驗證。

表2 ASFV亞單位疫苗及核酸疫苗

表3 病毒載體疫苗

復制缺陷型疫苗目前還無相關報道，其不具復制能力但最大程度保留了完整病毒顆粒所具有的免疫原性，相比弱毒活疫苗其免疫動物后不會產生排毒以及毒力反強等免疫副作用，是一種理想的疫苗。雖然復制缺陷型疫苗還未見報道，但已有相關的基因缺失毒株（BA71）被申請專利，如 PP220、pp62和pB438L基因缺失毒株[67]。

4 ASF疫苗研發瓶頸

ASF疫苗研發瓶頸主要體現在以下幾方面：（1）ASFV基因型眾多，所研發的疫苗交叉保護能力差，只能針對同源或者幾種非同源病毒具有保護作用。（2）大多數ASFV在常見的細胞系如ST、Vero中不能增殖，只有少數幾種毒株如Ba71 V或Georgia 07等可在Vero細胞中增殖，其他毒株只能通過豬單核-巨噬細胞或者網狀-內皮細胞中進行增殖且產量低[68-70]。 （3）ASFV 基因組龐大，多數基因功能未知，且編碼的許多蛋白具有免疫抑制作用，可協助病毒的免疫逃逸以利于病毒的復制與擴散[20,71]。（4）疫苗免疫后可產生特異性抗體但并不能抵抗病毒入侵，即產生的抗體并非中和抗體。（5）ASFV可在單核巨噬細胞中大量增殖，而單核巨噬細胞在抗原呈遞、誘導T細胞活化及激活啟動免疫應答等方面具有重要作用，ASFV對單核巨噬細胞系統破壞無疑會削弱豬的免疫力，促進病毒感染。

5 總結與展望

目前，針對ASF沒有疫苗預防，疫情仍然時有暴發。根據目前疫苗研究現狀可知，滅活苗、亞單位疫苗、核酸疫苗免疫后保護能力極差甚至無保護作用。病毒載體疫苗需多次免疫或以“雞尾酒”式免疫或可取得一定免疫效果，且多數病毒載體疫苗保護效果有待驗證。弱毒活疫苗保護效果參差不齊，自然致弱毒株毒力不穩定、易反強，人為致弱毒株保護效果因不同基因缺失其保護效果也不同，但總體優于滅活苗、亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗。復制缺陷型疫苗的研發還未見詳細報道，其免疫保護效果未知，但其安全性好，不存在毒力反強現象，研發該類疫苗也是研發ASF疫苗的一個突破方向。對于弱毒活疫苗的構建，應當針對與免疫抑制相關基因如MGF360 成員、MGF505 成員、DP96R、CD2v、DP148R、9GL 等基因的刪除，但 9GL、MGFs、TK、NL等基因不宜同時剔除，以免降低疫苗免疫原性導致免疫后不能提供保護。

隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術的發展，可針對ASFV特定基因進行刪除，構建弱毒株及復制缺陷型毒株或定點敲除某個基因構建重組疫苗株，該技術將加快ASF弱毒活疫苗、復制缺陷型疫苗及重組疫苗的研發。隨著基因合成技術的發展，可構建全基因組敲除文庫，應用全基因組敲除文庫可篩選出ASFV宿主依賴因子及互作蛋白，針對這些因子及蛋白可設計相應多肽類、小分子化合物類以及篩選出天然抗病毒藥物等。cGAS-STING通路的發現，揭示了cGAMP作為第二信使可與其接頭蛋白STING結合并激活下游信號，可激活Ⅰ型干擾素的表達[72-74]，由于ASFV多個蛋白如MGF360/505家族、DP96R與EP153R等可抑制宿主細胞Ⅰ型干擾素和ISGs的產生，調控細胞凋亡、蛋白合成和自噬等多種信號通路[20]，若將cGAMP作為新型疫苗佐劑可逆轉ASFV對干擾素表達的抑制，從而可加強機體的抗病毒反應，增強疫苗免疫效果。鑒于目前ASF疫苗研發的進展，不難發現弱毒疫苗保護能力優于滅活苗、亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗，弱毒活疫苗極有可能成為第一個用于預防非洲豬瘟疫情的疫苗類型。