CRISPR/Cas9技術及其在水稻和小麥遺傳改良中的應用綜述

馬斯霜 白海波 惠建 呂學蓮 陳曉軍 李樹華

摘要：CRISPR/Cas9技術是新發展的定向基因編輯技術，CRISPR/Cas9技術是在細菌和古細菌中發現的1種抵御外來病毒及質粒入侵的獲得性免疫系統。CRISPR/Cas9技術由sgRNA（單向導RNA）介導，與Cas9核酸酶切割實現作物定點編輯改良。本文主要對CRISPR/Cas9技術的工作原理、系統分類、結構、系統構建方法進行了系統介紹。同時，總結了CRISPR/Cas9技術在水稻和小麥的突變體庫的建立和基因功能研究、品質和農藝性狀遺傳改良等方面的研究。并對CRISPR/Cas9技術對作物進行定向編輯改良進行了展望，以期為利用CRISPR/Cas9技術創制新品種、作物品種改良提供參考。

關鍵詞：CRISPR/Cas9;基因編輯;遺傳改良;水稻;小麥

中圖分類號：Q789?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0029-04

世界人口持續增長、耕地面積減少、生態環境逐步惡化等因素，為糧食的持續性穩定供給增加了風險[1]。對作物進行遺傳改良，提高作物的產量、品質、抗逆性以應對人口增長和氣候變化是育種人員首要解決的問題[2]。雖然傳統育種技術解決上述問題已取得一定效果，但依靠雜交創制新品種，選育穩定優良品種耗時長，成本高，在選擇過程中容易造成優良基因的丟失，且遺傳相似性較高。分子標記輔助育種（MAS）常因多代回交和連鎖累贅而丟失分子標記，影響作物遺傳改良的進程。傳統的基因編輯技術以基因重組為基礎進行基因組定向修飾，但該技術存在脫靶率高、周期長、應用范圍窄等缺點。

隨著現代生物技術的迅速發展，大量物種的全基因組測序已經完成，為用基因編輯、基因工程等技術對作物進行遺傳改良奠定了基礎。作物遺傳改良已經由常規雜交向定向編輯改良轉變。基因編輯可直接對基因組或者轉錄產物進行定向編輯，通過片段的插入、替換、敲除等定點編輯修飾。基因編輯技術極大地加速了生命科學研究進程[3-4]。基因編輯技術通過模板識別靶位點序列，核酸酶對靶位點切割造成DNA雙鏈斷裂（double strand breaks，簡稱DSBs），以及DSBs 激活DNA損傷修復應答機制，即非同源末端連接（non-homologous ending-joining，簡稱NHEJ）或同源重組（homologous recombination，簡稱HR）。NHEJ可在酶切位點發生堿基的插入或缺失;在有同源供體DNA時HR會導致靶位點序列的替換[5-6]。現主要有3種基因編輯技術：鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，簡稱ZFNs）、TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，簡稱TALENs）和CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9）[7]。ZFNs與TALENs技術根據靶位點序列設計識別蛋白模板，FokⅠ內切酶與蛋白模板融合切割;CRISPR/Cas9技術，只需根據靶位點序列設計20個核苷酸的gRNA（向導RNA），Cas9切割DNA[8]。CRISPR/Cas9技術因其簡潔的操作、低脫靶率等優點，將基因編輯技術的完善與應用推向了新高潮。

1?CRISPR/Cas9的簡介

CRISPR/Cas9是新發展的定向基因編輯技術。由于易操作、成本低且脫靶率低，被Science評為2013年十大科學進展之一[9]。CRISPR/Cas9是在細菌和古細菌中發現的一種抵御外來病毒及質粒入侵的獲得性免疫系統[10]。CRISPR/Cas9系統由CRISPR位點、Cas蛋白、編碼DNA序列組成，并因操作性強、編輯效率較高等優點，已經被用于小麥、水稻、玉米、擬南芥等植物中。

1.1?CRISPR/Cas9技術的作用原理

細菌和古細菌的CRISPR/Cas9系統抵御外來病毒及質粒侵染的免疫機制有3個階段[11-13]。首先是外源DNA的獲取，外源DNA侵入時，識別PAM區域，鄰近PAM的DNA序列作為原間隔序列，蛋白復合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來，通過鑒定、加工整合到CRISPR 位點。其次是crRNA的合成表達階段，CRISPR在前導區的調控下轉錄出precursor-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和trans-acting crRNA（tracrRNA），tracrRNA、pre-crRNA和Cas9 蛋白在RNase（核糖核酸酶）的作用下產生crRNA。crRNA通過堿基配對與 tracrRNA 結合形成 tracrRNA/crRNA復合物[14-15]，此復合物引導核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。最后是靶向干擾階段，以上2種RNA復合物被改裝成1個向導RNA（single-guideRNA， 簡稱sgRNA） [16-17]。這個sgRNA與Cas9對DNA雙鏈進行切割，在完整基因組上的特定位點完成切割反應，sgRNA序列還可借助特定軟件進行設計。sgRNA和Cas9與外源DNA進行識別，并識別出與crRNA互補的原間隔序列，復合物將被定位到PAM原間隔序列的區域，形成R-Loop[18-19]。Cas9 剪切與crRNA互補的DNA鏈，雙鏈斷裂，形成DNA雙鏈斷裂（DSBs）。斷裂的雙鏈通過同源重組或非同源末端連接得到修復，從而達到對基因組編輯的目的。

1.2?CRISPR/Cas9分類及結構

細菌和古細菌中存在大量的Cas9蛋白，根據其結構、功能、對應的gRNA 不同等因素可大致分為3類。第1類在成熟的sgRNA中有1個莖環結構，需要與大量的Cas9蛋白形成1個蛋白復合體，可在sgRNA的作用下切割目的DNA片段。在第2類中需要的Cas蛋白較少，其sgRNA有多個莖環結構;該類型是CRISPR/Cas系統中最簡單，同時也是編輯效率最高的一類。第3類中Cas9蛋白形成2個不同形式的復合體，分別是Csm復合體和Crm復合體，其中Csm復合體結合sgRNA后切割目的DNA片段，而Crm復合體則可以結合sgRNA后去切割RNA分子。

CRISPR/Cas9系統主要由CRISPR位點、Cas蛋白構成[20]。CRISPR位點主要是由保守的重復序列和長度相似的間隔序列交替排列組成。間隔序列與一些質粒或者噬菌體的序列具有較高的同源性，間隔序列可使宿主細胞免疫外源DNA的入侵，是細菌及古生菌長期進化形成的一種適應性免疫系統。前導序列可以作為啟動子，使CRISPR位點的序列開始轉錄，轉錄出的RNA被命名為CRISPR RNAs（crRNAs）。Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系統的重要組成部分，Cas9剪切與crRNA互補的DNA鏈，DNA雙鏈斷裂。Cas9由1 409個氨基酸組成，主要有2個大小不同的結構域，是1種多結構域蛋白，主要包括大的球形特異性識別結構域（REC）和小的核酸酶功能域（NUC）;核酸酶結構域又進一步包含2個核酸酶位點RuvC和HNH，以及1個PAM-interacting位點[21]。

1.3?CRISPR/Cas9構建方法

CRISPR/Cas9系統的構建僅包括Cas9蛋白和gRNA的構建。Cas9蛋白和gRNA可分別在2個不同載體中構建，也可同時在1個載體中構建。這2種構建方法各具特點：將Cas9蛋白和gRNA構建在同一載體上可提高轉化效率，降低脫靶效率，該方式在轉化困難的作物中較為實用。將Cas9蛋白和gRNA分別構建在2個表達載體上，能快速檢測脫靶效率[22]。為使Cas9更高效地表達，構建時要對密碼子進行優化;gRNA的設計主要根據靶位點的 DNA 序列進行[23]。CRISPR/Cas9的轉化效率除了受Cas9和gRNA的構建影響外，還有很多其他因素。通常SNP（單核苷酸多態性）和環的循環越少，gRNA越有效;此外，脫靶效率還與gRNA-DNA雜交體的解鏈溫度具有較高的相關性，并與AT含量與脫靶效應呈負相關，因此AT百分比越高，脫靶效應越低[24]。

2?CRISPR/Cas9技術在水稻遺傳改良中的應用

水稻不僅是重要的糧食作物，也是重要的模式植物，相比于小麥復雜的遺傳結構背景，CRISPR/Cas9技術在水稻的基因編輯改良中更易操作。CRISPR/Cas9基因編輯技術在水稻基因功能研究、水稻品種改良、水稻突變體庫建立等方面表現出巨大的潛力。

2.1?CRISPR/Cas9技術在水稻突變體庫建立方面的應用

現代農業發展史中的2次綠色革命，都與突變體的研究密不可分。在自然環境中存在自發突變，但自發突變獲得的突變體進行基因功能的研究已經不能滿足生物學發展要求，CRISPR/Cas9技術利用反向遺傳學，已經在突變體庫的建立方面取得極大進展，進行大規模高通量篩選，為基因組學的研究與農業生產奠定了基礎。沈春修等通過CRISPR/Cas9，以粳稻臺北309為受體材料，對LOC_Os05g31750位點進行敲除，獲得6株成功敲除的突變體植株[25]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9構建載體，共敲除8個農藝性狀，在T0代檢測到雜合突變株和純合突變株[26]。此外，在突變株中發現了純合的六突突變株、七突突變株、八突突變株。原文霞等利用新的載體和方法，對水稻日本晴D3基因的3個位點分別構建了相應的CRISPR/Cas9載體，并獲得一系列轉基因植株，研究了純合突變體的株高、分蘗數表型與CRISPR/Cas9編輯后基因型之間的關系[27]。楊紹華等利用CRISPR/Cas9對水稻品種明恢86中的Os IPA基因突變體功能進行驗證，研究該基因在水稻花粉發育過程中的功能[28]。Mao等利用CRISPR/Cas9對Os MYB1基因進行定向編輯，獲得突變體，研究該基因功能[29]。Xie等利用CRISPR/Cas9技術對水稻負調節植物抗病性基因OsMPK5的3個位點分別進行編輯，驗證該基因對突變株抗病性的影響[30]。Feng等利用CRISPR/Cas9分別對ROC5（Rice Outermost Cell-specific gene5）、SPP（Stromal Processing Peptidase）、YSA（Young Seedling Albino）3個基因進行編輯，發現不同基因編輯產生的突變體間存在極顯著差異[31]。胡雪嬌等利用CRISPR/Cas9，以SD1基因為靶基因，研究該基因對突變株系株高的影響[32]。

2.2?CRISPR/Cas9技術在水稻品質改良中的應用

隨著人們對植物代謝途徑的研究不斷深入，利用分子技術對作物品質進行改良也取得顯著成效。隨著CRISPR/Cas9技術機制的不斷闡明，采用CRISPR/Cas9技術進行作物品質定向改良已顯現出巨大的潛力。目前，人們利用CRISPR/Cas9已經成功地對水稻進行不同方面的品質改良。馮璇等利用CRISPR/Cas9編輯技術將高產的非糯性品種轉為糯性品種，對保持系209B的Wx位點進行定點編輯，并轉育糯稻不育系WX209A且直鏈淀粉含量降低[33]。汪秉琨等利用CRISPR/Cas9編輯Wx基因，獲得了穩定遺傳、低直鏈淀粉含量的轉化株系[34]。Zhou等利用CRISPR/Cas9，在應用最廣泛的溫敏核不育TGMS基因中誘導特異性突變，并開發了新的“轉基因清潔”TGMS系，加速了不育系的育種，開發了雜種優勢[35]。劉維等通過CRISPR/Cas9技術，以感病品種麗江為材料，對抗病基因OsCOL9進行編輯，麗江抗病性顯著增強[36]。邵高能等通過CRISPR/Cas9對中花11的香味基因Badh2進行編輯，突變體材料中的香味物質顯著增加[37]。白建江等利用CRISPR/Cas9得到穩定的沒有潮霉素標記的高抗性淀粉水稻純合突變株，為高抗性淀粉育種提供了新的種質資源[38]。Wang等利用CRISPR/Cas9對粳稻 Kuiku131稻瘟病負調控抗性基因OsERF922進行編輯，發現純合突變系在苗期和分蘗期稻瘟病發病程度明顯比野生型低，且農藝性狀沒有發生明顯的變化[39]。

2.3?CRISPR/Cas9技術在水稻農藝性狀改良中的應用

作物品種改良的關鍵是對農藝性狀進行改良，利用控制農藝性狀的有利等位基因，通過分子標記輔助育種進行改良。雖然分子標記能夠對作物中許多控制重要農藝性狀的基因進行定位，但不能對目標性狀進行定向改造。CRISPR-Cas9能有目的地選擇一些有價值的等位基因在育種中應用。Xu等通過CRISPR/Cas9對粒質量基因GW2、GW5和TGW6同時進行編輯，得到gw5tgw6和gw2gw5tgw6突變體，其粒質量較野生型品種粳稻明顯增加，且3個基因間無互作關系[40]。Shen等利用CRISPR/Cas9對4個水稻品種的粒長和穗粒數進行定向編輯，且gs3和gs3nla突變體的粒長和千粒質量較野生型明顯增加[41]。韓嬌等通過CRISPR/Cas9對水稻中與McPht蛋白同源性最高的磷轉運蛋白基因進行編輯，并對突變體進行生理指標測定，水稻突變體的株高、鮮質量、根系活力均小于野生型，根系掃描結果顯示，水稻突變體的根長、投影面積、表面積和側根數均大于野生型[42]。孟帥等利用CRISPR/Cas9編輯控制粒長基因GS3，對后代植株粒型進行考察，gs3突變體的粒長均顯著長于野生型[43]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9，以控制粒型基因GS3和控制每穗粒數基因Gn1a為靶基因，轉化4個優質水稻品種，突變體gs3和gs3gn1a 與野生型相比粒長變長，千粒質量增加;突變體gs3gn1a與突變體gs3相比，每穗粒數顯著增加[44]。Miao等利用CRISPR/Cas9 系統分別研究CAO1和LAZY1基因對突變株葉綠素B的合成和分蘗夾角的影響[45]。Li 等對粳稻Zhonghua11中的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1與產量相關的4個基因編輯，Gn1a、DEP1和GS3純合突變株穗粒數、直立型密穗數和千粒質量顯著增加，且DEP1和GS3突變植株中出現了半矮稈和長芒現象，而IPA1突變株中出現了多蘗和少蘗2種現象[46]。

3?CRISPR/Cas9系統在小麥遺傳改良中的應用

小麥是異源多倍體，其基因組較為龐大，高倍性和高度重復的DNA序列使得其正向和反向遺傳分析均難以進行。因其復雜的遺傳結構、巨大的基因組（17Gb）和對轉化的頑固，對小麥基因組進行定點編輯相對困難[47]。近年來，CRISPR/Cas9已經在小麥上廣泛應用。利用CRISPR/Cas9對小麥進行遺傳改良的研究也廣泛開展。Yi等在CRISPR/Cas9的基礎上對單個Ta MLO位點進行誘導，獲得4個突變體植株，表明CRISPR/Cas9可在多倍體的小麥中誘導形成有利突變[48]。Shan等利用CRISPR/Cas9對控制小麥籽粒形狀和分蘗基因Ta GASR7、Ta DEP1定點編輯，純合敲除突變體的千粒質量和分蘗數明顯增加，但株高降低[49]。Liang等在CRISPR/Cas9編輯技術的基礎上進行改善，通過粒子轟擊傳遞CRISPR/Cas9的體外轉錄物（iVts）或核糖核蛋白復合物（rnps）對小麥進行編輯[50]，不僅避免了CRISPR/Cas9隨機整合到基因組DNA，還降低了脫靶率，并可在短期內獲得再生株系。Bhowmik等將CRISPR/Cas9技術與小孢子技術相結合，并優化了單倍體誘變系統[51]。使用Cas9和sgRNA，對小麥的1個Ds Red外源基因和2個內源基因（Ta Lox2和Ta UbiL1）進行靶向修飾，驗證了將小孢子和CRISPR/Cas9基因編輯技術相結合用于作物改良的可行性。Liang等利用基因槍粒子轟擊技術分別將7個不同目的基因的CRISPR/Cas9 的DNA分別導入到二倍體硬質小麥和六倍體面包小麥的愈傷中，在不使用任何篩選標記的情況下快速獲得相應基因的突變株系[52]。Zhang等通過CRISPR/Cas9 RNPs將gw2-RNPs轉化到小麥原生質體中，gw2-RNPs誘導的Ta GW2基因在小麥A、B、D染色體組的突變頻率分別為94.3%、33.4%、21.8%[53]。Shan等利用CRISPR/Cas9，對水稻和小麥進行序列特異性基因編輯并且小麥雙等位基因pds突變體具有預期的表型[54]。

4?展望

CRISPR/Cas9系統是生命科學的重大發現之一，具有廣泛的發展和應用前景。可以定點敲除不利基因，對作物進行定向改良，也可進行基因替換、插入，使一些優良基因在其他作物中穩定遺傳。既能夠解決傳統育種技術與分子標記輔助育種的弊端，拓寬選育品種的遺傳背景，見效快;又能避免轉基因育種技術帶來的安全問題，精準地達到育種目標，品種的安全性更高。毫無疑問，CRISPR/Cas9系統將成為作物育種和改良的重要技術。但CRISPR/Cas9 系統也存在一些問題。CRISPR/Cas9技術目前在水稻遺傳改良中相對比較成熟，在其他作物的基因編輯改良中需要進一步改善優化，使得CRISPR/Cas9技術可以在多種作物中廣泛應用，提高突變率;脫靶效應高和同源重組（HR）編輯效率低是CRISPR/Cas9技術難以攻克的難題，需要進一步加強完善，降低脫靶效應;解決能夠同時對多個不同基因進行定點精準編輯的問題。目前，CRISPR/Cas9系統在作物遺傳改良的應用還處于初級階段，也在不斷完善發展，相信在將來能克服種種困難，對作物進行定向改良，獲得更優質、更理想的品種，將成為作物育種的重要生物技術。

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