培養條件對木薯胚性愈傷組織中3種保護酶活性的影響

黎萍 李恒銳 楊海霞 梁振華 馬仙花 何文 劉連軍

摘要：以GR891木薯胚性愈傷組織為材料，常規保存（GD培養基+12.0 mg/L毒莠定+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂）培養基為對照（CK），研究處理培養基中添加不同濃度蔗糖（25、30、35、40 g/L）、甘露醇（20、30、40、50 g/L）和多效唑（4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）對木薯胚性愈傷組織保存40 d時超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性的影響。結果表明，在20 ℃條件下，處理組與對照組SOD、POD、CAT活性呈先升高后降低的趨勢，甘露醇和多效唑處理比蔗糖處理的3種保護酶活性高，下降的速度也較緩慢。與對照相比，蔗糖和甘露醇濃度均為 30 g/L 脅迫時，SOD、POD、CAT活性同時出現峰值，且一直維持較高水平;隨著多效唑濃度（4.0～8.0 mg/L）的升高，SOD、POD、CAT活性不斷升高，多效唑濃度為8.0 mg/L時木薯胚性愈傷組織中3種保護酶活性最高。說明將木薯胚性愈傷組織保存在添加蔗糖或甘露醇30 g/L、多效唑8.0 mg/L的常規固體培養基上，可以有效地延長木薯胚性愈傷細胞壽命，延緩保存時細胞的衰老。

關鍵詞：木薯;胚性愈傷組織;SOD;POD;CAT;蔗糖;甘露醇;多效唑

中圖分類號： S533.01?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0080-04

木薯是世界三大薯類作物（木薯、馬鈴薯、甘薯）之一[1]。傳統的田間種植保存易受病蟲害、自然災害及經費短缺等弊端的困擾，這使得大量的木薯資源面臨流失的可能。緩慢生長保存法是對木薯胚性愈傷組織進行離體種質保存的重要手段，其易于控制，且便于種質交流，需要時，能隨時將保存材料大量繁殖[2]。緩慢生長保存是指通過添加滲透劑（蔗糖、甘露醇、山梨醇等）或生長抑制劑（比久、多效唑、烯效唑等）提高培養基的滲透壓、改變植物生長培養條件來限制培養物生長，使植物組織因缺水而減弱新陳代謝，導致植物的細胞壁酶活性受到抑制，最終實現延緩生長的目的。

細胞內的保護酶系統主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等。SOD是清除活性氧反應過程中第1個發揮作用的抗氧化酶，且廣泛參與植物體在各種逆境脅迫下的生理生化反應，對抗衰老和抗干旱都起到積極的作用[3]。POD是廣泛存在于植物體內且功能較多的酶類，可清除活性氧，降低活性氧對細胞膜過氧化程度，減少膜脂過氧化，穩定膜系統[4]。CAT是植物體內的保護酶之一[5]，CAT和POD能作為愈傷組織生長過程中增殖和衰老的標志酶[6]。POD、CAT、SOD活性的變化與愈傷組織的生長及分化過程密切相關。有關植物胚性愈傷組織離體保存與細胞內保護酶系統活性變化的研究已有報道，黎金燕等的研究表明，培養基中附加1種抑制劑（DPI）可以促進尾葉桉胚性愈傷組織的誘導，從而提高POD、CAT、SOD等抗氧化酶活性[7]。曾麗蘭等研究發現，適當濃度的甘露醇和蔗糖，不僅可以有效提高植物細胞活力，而且還可以提高植物胚性愈傷組織中SOD活性[3-8]。劉懷攀等研究發現，在培養基中添加聚乙二醇（PEG）-6000和脫落酸（ABA）可以顯著提高水生蘆葦胚性愈傷組織中的CAT、POD活性[9]。葉煒等的研究表明，較高濃度的甘露醇處理可使胚性愈傷組織的SOD活性升高，考慮延緩衰老，均在培養基中加入20 g/L甘露醇以有效提高植物SOD活性[10-12]。目前，除黎萍等的報道[8]外，有關培養基成分與木薯胚性愈傷組織中的抗氧化酶活性之間的聯系尚未見報道。為探討SOD、POD、CAT活性與木薯胚性愈傷組織抗衰老之間的關系，研究在不同培養條件下保存40 d時木薯胚性愈傷組織中SOD、POD、CAT活性的變化，以期尋求一種更適合木薯離體種質的高效長期保存方法。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試材料

以廣西亞熱帶作物研究所培育的木薯品種GR891為試驗材料，對木薯嫩枝、側芽進行水洗、滅菌，然后將其接種到MS+1.0 mg/L 6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）+0.5 mg/L萘乙酸（NAA）+25.0 g/L蔗糖+6.5 g/L 瓊脂的固體培養基上，培養45 d后獲得木薯試管苗。對無菌試管苗的腋芽采用MS改良培養基（MS+2 mol/L CuSO4+12 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂）誘導胚性愈傷組織，然后用常規固體保存培養基（GD培養基+12.0 mg/L毒莠定+25.0 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂）進行增殖培養，獲得繼代胚性愈傷組織。以上培養基pH值均為5.8，培養條件為（20±1） ℃，光照度為1 000～1 200 lx，光照時間為 16～18 h/d。

1.1.2?試驗儀器

JJ500型電子分析天平，購自常熟市雙杰測試儀器廠;SW-CJ-1FD型超凈工作臺，購自蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;YZM-60B高壓滅菌鍋，購自廣州豪爾生醫療設備有限公司;T6新世紀紫外分光光度計，購自北京普析通用儀器有限公司;YR11-2A磁力攪拌器，購自上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;LRH-400-G光照培養箱，購自韶關市泰宏醫療器械有限公司;CT15RT型高速冷凍離心機，購自上海天美生化儀器設備工程有限公司。

1.1.3?試劑

愈創木酚，由天津市光復精細化工研究所提供;氮藍四唑，由合肥博美生物科技有限責任公司進口分裝;核黃素，購自天津市大茂化學試劑廠;甲硫氨酸，由合肥博美生物科技有限責任公司進口分裝;Na3-乙二胺四乙酸（EDTA），購自上海埃彼化學試劑有限公司;KH2PO4，購自天津市大茂化學試劑廠。

1.2?試驗方法

1.2.1?培養條件對木薯胚性愈傷組織生長保存的影響

在GD培養基+12.0 mg/L毒莠定+6.5 g/L瓊脂固體培養基中分別附加25、30、35、40 g/L蔗糖;在常規固體保存培養基上添加不同濃度甘露醇（20、30、40、50 g/L）和不同濃度的多效唑（4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L）。選取繼代3～5代生長良好的顆粒狀木薯胚性愈傷，接種在上述培養基中，以不添加任何物質的常規培養基培養為對照（CK），每個處理接15皿，每培養皿接入胚性愈傷組織1 g，均放置在溫度為20 ℃，光照度為 1 500～2 000 lx，光照時間為16 h/d的溫室中培養，40 d后，分別測定SOD、POD、CAT活性的變化，每個處理重復3次。

1.2.2?測定方法

1.2.2.1?粗酶液的提取

稱取愈傷組織材料0.5 g，加入7倍體積0.1 mol/L磷酸緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮，pH值7.0）和少量石英砂，置于冷凍好的研缽中研磨成勻漿，將勻漿液移入離心管中并低溫抽提1 h，然后于4 ℃、15 000 r/min條件下離心 20 min。將上清液移至5 mL離心管中低溫保存，并記錄上清液的體積（V），所得的上清液即為含游離態SOD、POD、CAT的粗酶液。

1.2.2.2?SOD活性測定?SOD活性測定參考黎萍等的方法[8]并略加改進，所需的反應母液為0.05 mol/L pH值7.8磷酸緩沖液、130 mmol/L 甲硫氨酸（MET）溶液、750 μmol/L氮藍四唑溶液、100 μmol/L EDTA-Na2溶液、20 μmol/L核黃素溶液，其中，將EDTA-Na2溶液和核黃素溶液合并在一起配制，當測定SOD活性時，將該混合液稀釋100倍再使用。取3只對照管和1只樣品管，添加一定量上述反應母液（磷酸緩沖液1.7 mL，MET溶液0.3 mL，氮藍四唑溶液0.3 mL，EDTA-Na2溶液0.3 mL，核黃素溶液0.3 mL，酶液0.1 mL），然后往樣品管中添加2.0 mL酶液，3只對照管添加1.0 mL提取緩沖液來代替酶液，反應體系的總量為3.0 mL。將1支對照管置于暗處，其余各管置于4 000 lx日光燈下反應 30 min，然后立即取出置于暗處終止反應。以避光管作為空白參比調零，分別測定其他各管在560 nm處的D值。以 1 min、1 g愈傷組織抑制NBT光化還原的50%來作為1個酶活性單位，用U/g表示，3次重復。

SOD活性=（Dc-Dt）×V/（0.5×Dc×Vt×m）。

式中：Dc為對照管吸光度;Dt為樣品管吸光度;V為樣品提取液總體積，mL;Vt為測定時樣品用量，mL;m為愈傷組織鮮質量，g。

1.2.2.3?POD活性測定

過氧化物酶（POD）活性參考朱廣廉等的方法[13]并略加改進，采用愈創木酚法測定，反應混合液由50 mL 0.05 mol/L pH值6.0磷酸緩沖液、19 μL 30% H2O2、28 μL愈創木酚（原試劑）混合而成，配制時先將磷酸緩沖液與愈創木酚混合加熱溶解，冷卻后再加入H2O2混勻即可。當進行POD測定時，先往一個測定管中添加反應混合液3 mL，以1 mL提取緩沖液代替酶液加入到該混合液中，混勻后作為空白對照調零。同樣往另一測定管中添加反應混合液3 mL，加入1 mL酶液（事先已將其濃度稀釋10倍），然后立即開啟秒表計時，于 470 nm 條件下測D值，每隔30 s讀1次數值，讀數3 min，以1 min內D值變化作為1個POD活性單位，3次重復。

POD活性=（D470 nm×V×K）/（1×m×Vt×T）。

式中：K為稀釋倍數;D470 nm為樣品管吸光度;V為樣品液總體積，mL;Vt為測定時樣品用量，mL;m為愈傷組織鮮質量，g;T為光照反應時間，min。

1.2.2.4?CAT活性測定?過氧化氫酶（CAT）活性測定參照李玲等的方法[14]，酶促反應體系由2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液和100 μL酶提取液組成，以蒸餾水為參比空白，在反應15 s時開始記錄反應體系在波長為240 nm處的吸光度，作為初始值，然后每隔 30 s 記錄1次，連續測定6個點數據。以 1 g 木薯胚性愈傷組織（鮮質量）1 min吸光度變化值減少0.01為1個CAT活性單位，3次重復。

CAT活性=ΔD240 nm×V/（0.01×Vs×m）。

式中：ΔD240 nm為樣品管吸光度變化量;V為樣品提取液體積，mL;Vs為測定樣品提取液體積，mL;m為愈傷組織鮮質量，g。

1.3?數據處理與分析

采用Excel 2003和SPSS 22.0軟件對數據進行統計處理，采用Duncan's新復極差法進行差異顯著性分析。

2?結果與分析

2.1?不同濃度蔗糖處理對木薯胚性愈傷組織中3種保護酶活性的影響

蔗糖既是植物組織培養中的最主要碳源，也是重要的滲透調節物質[3]。由表1可知，保存期間蔗糖處理的木薯胚性愈傷組織SOD、POD、CAT活性均高于對照組，表現出隨著蔗糖處理濃度的升高，SOD、POD、CAT活性先升高后下降的趨勢，活性最高點均出現在蔗糖濃度為30 g/L時，此時與其他處理差異顯著（P<0.05）;表明在蔗糖滲透脅迫下，較高活性的保護酶系統能夠有效地清除木薯胚性愈傷組織內過多的活性氧，維持活性氧產生與清除之間的動態平衡。蔗糖濃度超過35 g/L時，SOD、CAT活性開始緩慢下降，而POD活性表現急速下降，說明活性氧的增加遠大于正常清除能力，過多的氧自由基使細胞內多種功能膜及酶系統遭到不同程度的破壞，生理代謝紊亂，POD活性就可能受到抑制而急速下降[15]。由此可以看出，適當濃度的蔗糖可以提高木薯胚性愈傷組織的抗氧化酶活性。

2.2?不同濃度甘露醇處理對木薯胚性愈傷組織中3種保護酶活性的影響

甘露醇是活性氧清除劑[16]，作為一種重要的多元醇，還可直接清除·OH，抵抗氧化反應[17]。由表2可以看出，隨著甘露醇濃度（0～30 g/L）的不斷升高，木薯胚性愈傷組織中的SOD、POD、CAT活性不斷升高，其中20、30 g/L甘露醇處理與對照差異顯著。30 g/L甘露醇處理的3種保護酶活性維持在較高的水平上，SOD、POD、CAT活性值分別比對照升高63.27%、56.42%、59.81%，除濃度在30～40 g/L之間POD活性差異不顯著外，其他各處理之間的3種保護酶活性均差異顯著，說明脅迫處理下胚性愈傷細胞中3種保護酶活性被誘導升高，直到濃度高達40 g/L時才開始呈現緩慢下降的趨勢，這可能是由于高濃度處理超出了細胞的生理耐受和反應極限，破壞了正常細胞生理活動。由此可見，甘露醇濃度為30 g/L時可以有效增強木薯胚性愈傷組織的SOD、POD、CAT活性，且3種保護酶活性升高與愈傷組織抗衰老密切相關，可作為愈傷組織生長過程中增殖和衰老的標志酶。

2.3?不同濃度多效唑處理對木薯胚性愈傷組織中3種保護酶活性的影響

多效唑作為高效低毒的植物生長延緩劑，可以延長培養物在試管中的保存時間[18]。由表3可以看出，木薯胚性愈傷組織在多效唑濃度為4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L處理下，SOD、POD、CAT活性顯著高于對照，8.0 mg/L多效唑處理的3種保護酶活性維持在較高的水平上，分別比對照升高63.09%、63.73%、93.20%，SOD、POD、CAT活性的最高值是愈傷組織生長高峰期到來的標志。3種保護酶活性隨著多效唑濃度的升高呈先升后降的趨勢，6.0 mg/L與8.0 mg/L多效唑處理下，木薯胚性愈傷組織中的SOD、POD活性差異不顯著，8.0 mg/L 多效唑處理的CAT活性與其他處理組差異顯著，10.0 mg/L濃度處理下，3種保護酶活性急速下降，說明培養基添加多效唑在一定程度上使3種保護酶活性增強，從而減弱膜脂過氧化作用，有效地延長愈傷組織的繼代周期。綜合分析認為，生長延緩劑多效唑在木薯胚性愈傷保存中的適宜濃度為8.0 mg/L。

3?結論與討論

SOD、POD、CAT是抗氧化酶系統中控制植物體內活性氧積累的最主要的3種保護酶，其活性變化與衰老密切相關。抗氧化酶活性的提高有利于減緩愈傷組織中活性氧對細胞的氧化損害，減緩其細胞膜質過氧化并抑制褐化[19]。POD是廣泛存在于各種動物、植物和微生物體內的一類氧化酶，其與SOD共同作用能減輕或消除氧自由基對植物生長發育的不良影響[20]。CAT廣泛存在于植物體內，其活性與植物體的成熟衰老關系非常密切[21]。本試驗結果表明，在常規固體保存培養基（GD培養基+12.0 mg/L毒莠定+6.5 g/L瓊脂）上附加蔗糖30 g/L、甘露醇30 g/L、多效唑8.0 mg/L時，木薯胚性愈傷組織的3種保護酶活性均有一定幅度的增強，可在一定程度上延緩解木薯胚性愈傷細胞的衰老，有效地延長愈傷組織的繼代周期，進而達到延長保存時間的目的，是一種對木薯種質資源離體保存的方法。

蔗糖是植物組織培養中不可缺少的碳源和能源，同時還起著調節滲透壓的重要作用[22]。本試驗結果表明，經蔗糖處理保存的木薯愈傷組織的SOD、POD、CAT活性比常規保存的對照處理高，在30 g/L蔗糖濃度脅迫下，3種保護酶活性一直維持在較高的水平上，主要原因是添加蔗糖后，培養基碳源充足，細胞生命活動旺盛，過快的生理反應使活性氧的產生較多，高濃度（35～40 g/L）蔗糖迫脅下呈下降趨勢，不利于木薯胚性愈傷離體保存。

在植物離體保存研究中，常利用甘露醇來延緩細胞衰老，以達到延長繼代時間的目的。甘露醇在植物組織培養中是一種調節滲透壓的添加劑，通過給植物造成“饑餓”的作用，延緩植物代謝速率，達到延緩衰老的目的，在多種植物的保存試驗中均取得了很好的效果[23-25]。不同植物培養物保存所需要滲透壓并不相同，本試驗研究得出，30 g/L甘露醇能將木薯胚性組織的3種保護酶活性維持在較高水平。

離體保存成功的關鍵因素之一是使用合適的植物生長抑制劑。多效唑（PP333）是一種生長延緩劑，對植物的營養生長有較強的抑制作用，在荔枝胚性愈傷組織保存試驗中取得較好效果[26]。本試驗結果表明，在常規保存培養基中添加不同濃度的生長抑制劑多效唑，對木薯胚性愈傷組織保存試驗中3種保護酶活性影響差異較大，其中8.0 mg/L多效唑處理顯著高于對照，3種保護酶活性一直維持較高水平，說明能延緩細胞衰老，延長繼代時間。綜合試驗結果，8.0 mg/L多效唑處理較適合木薯愈傷組織中離體保存。

參考文獻：

[1]沈?光. 廣西木薯產業的發展前景與對策[J]. 熱帶農業科學，2001，90（2）：24-27，39.

[2]徐志微，楊麗麗，杜國強，等. 培養基滲透壓和生長調節劑對葡萄種質離體保存的效應[J]. 分子植物育種，2014，12（4）：720-725.

[3]曾麗蘭，林玉玲，王亞婷，等. 滲透脅迫對龍眼胚性愈傷組織SOD活性的影響[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），2014，43（1）：14-19.

[4]岑忠用. 3種抗氧化劑對巖黃連愈傷組織細胞活力與抗氧化酶活性的影響[J]. 現代農業科技，2015（15）：75-76，78.

[5]劉敏燕，沙月娥，歐陽樂軍，等. 尾巨桉愈傷組織蛋白質含量和氧化酶活性比較[J]. 湖北農業科學，2014，53（11）：2581-2583，2587.

[6]林小蘋，賴鐘雄，黃?淺. 不同光質對龍眼胚性愈傷組織生長和細胞膜保護酶活性的影響[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），2008，37（3）：253-256.

[7]黎金燕，王春暉，黃俊文，等. DPI對尾葉桉愈傷組織誘導和抗氧化酶活性的影響[J]. 湖北農業科學，2017，56（11）：2153-2156.

[8]黎?萍，彭靖茹，黃秋偉，等. 培養條件對木薯胚性愈傷組織SOD活性的影響[J]. 湖北農業科學，2015，54（8）：2009-2012.

[9]劉懷攀，陳?龍，張承烈，等. 滲透脅迫和外源ABA對蘆葦愈傷組織中3種保護酶活性的影響[J]. 植物生理學通訊，2002，38（1）：27-29.

[10]葉?煒. 福建龍眼種質資源離體保存初步研究[D]. 福州：福建農林大學，2006.

[11]林秀蓮. 龍眼胚性愈傷組織限制生長保存及其生理與遺傳機理的研究[D]. 福州：福建農林大學，2009.

[12]王梓清，劉愛萍，王家福. 培養條件對荔枝胚性愈傷組織保存中生理指標的影響[J]. 福建果樹，2008，145（2）：12-15.

[13]朱廣廉，鐘海文，張愛琴. 植物生理學實驗[M]. 北京：北京大學出版社，1990.

[14]李?玲，李娘輝，蔣素梅，等. 植物生理學模塊實驗指導[M]. 北京：科學出版社，2009.

[15]史雨剛，吳治國，馬金虎. 不同濃度NaCl脅迫對高粱幼苗SOD、POD酶活性的影響[J]. 山西農業科學，2007，35（12）：71-73.

[16]陳文利，徐朗萊，沈文飚，等. 鹽脅迫下兩品種大麥葉片H2O2累積及其清除酶活性的變化[J]. 南京農業大學學報，1999，22（2）：97-100.

[17]Shen B，Jensen R G，Bohnert H J. Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals[J]. Plant Physiology，1997，115（2）：527-532.

[18]郭?勇，崔堂兵，謝秀禎. 植物細胞培養技術[M]. 北京：化學工業出版社，2004：194-203.

[19]蘇?江，岑忠用，奉艷蘭，等. 抗壞血酸對巖黃連愈傷組織褐化及抗氧化酶活性的影響[J]. 北方園藝，2015（20）：138-142.

[20]覃?鵬，劉葉菊，劉飛虎. 干旱處理對煙草葉片SOD和POD活性的影響[J]. 中國煙草科學，2005，26（2）：28-30.

[21]馬凌云，趙?亮. 嘧菌酯處理對厚皮甜瓜POD和CAT活性的影響[J]. 食品科技，2008，33（11）：64-66.

[22]劉藝平，王?政，牛佳佳，等. 不同糖源及蔗糖質量濃度對牡丹愈傷組織褐化的影響[J]. 河南農業科學，2013，42（3）：103-106.

[23]王愛華，文曉鵬. 半夏緩慢生長法保存及體細胞變異的ISSR檢測[J]. 西北植物學報，2012，32（8）：1698-1703.

[24]韋坤華，李林軒，繆劍華，等. 姜種質資源離體保存技術研究[J]. 北方園藝，2013（8）：112-116.

[25]付傳明，黃寧珍，趙志國，等. 廣西地不容種質離體保存技術研究[J]. 廣西科學，2007，14（2）：155-159.

[26]王梓清，劉愛萍，胡曉媛，等. 荔枝胚性愈傷組織誘導和離體保存條件的篩選[J]. 植物資源與環境學報，2009，18（1）：80-86.