棉花多肽的分離提取方法建立及質(zhì)譜鑒定

袁娜 戴琛 楊郁文 杜建廠 張保龍

摘要：多肽是一類小分子物質(zhì)，在植物生長、發(fā)育及抗逆等眾多生命過程中起著重要的調(diào)控作用。旨在探索棉花根部多肽的分離提取方法，建立基于改良尿素法的棉花多肽組樣品收集方法。基于該方法，筆者在棉花根部組織中獲得809個小分子肽序列，這些多肽的大小在10～70個氨基酸之間。隨后，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，筆者進一步對獲得的多肽進行來源鑒定和序列分析。通過功能注釋和亞細胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這些多肽來源的基因在結(jié)合和催化活性、細胞過程、代謝過程功能亞類中所占比例最高，并且這些基因大多分布在細胞質(zhì)中（52%）。此外由結(jié)果還可以看出，與抗病防衛(wèi)相關(guān)的蛋白包括PR10、包含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的蛋白、過氧化氫酶、氧化還原酶等來源的多肽還伴有甲酰化、脫酰胺基化、乙基化等10種以上的氨基酸修飾方式。該技術(shù)為后續(xù)棉花多肽組學(xué)研究、棉花多肽數(shù)據(jù)庫的建立，以及挖掘如抗病抗逆相關(guān)的多肽應(yīng)用于生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：棉花;多肽;蛋白質(zhì)組學(xué);質(zhì)譜分析

中圖分類號： S562.01?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0095-04

多肽是一類由10～100個氨基酸組成的、由前體多肽經(jīng)過加工剪切后形成的成熟、具有特殊功能的肽類信號分子[1]。在動物、細菌、真菌中，功能活性肽在機體的生長發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用，它們作為藥物、疫苗、酶抑制劑、導(dǎo)向藥物及藥物先導(dǎo)藥等已在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用，具有非常高的應(yīng)用價值[2-3]。隨著系統(tǒng)素（systemin）、植物磺肽素（phytosulfokine，簡稱PSK）、CLE、SCR（SP11）、CLV3等植物多肽分子的陸續(xù)鑒定，證實了這類物質(zhì)可以作為信號分子介導(dǎo)細胞與細胞之間的短距離信息交流，在植物生長、發(fā)育及抗逆等眾多生命過程中起著重要的調(diào)控作用[1，4]。

植物內(nèi)源活性多肽不僅可以通過基因工程導(dǎo)入植物中進行過表達，以改善植物的生長發(fā)育及抗逆抗病性，還可以用作生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑，用來直接外源噴施植株，以提高植物的生長和抗逆能力。例如Zhang等分別將alfAFP基因及花煙草中的防御素NaD1基因轉(zhuǎn)入陸地棉后，植株對黃萎病病菌的抗性顯著增強[5-6]。將人工合成的抗菌肽轉(zhuǎn)入棉花中，也同樣增強了植株對黃萎病病菌的抗性[7-8]。此外，Huffaker等用ZmPep1多肽體外處理玉米葉片，可以減小由死體營養(yǎng)型病原菌玉米小斑病病菌（Cochliobolis heterostrophus）和半活體營養(yǎng)型病原菌玉米莖腐病病菌（Colletotrichum graminicola）引起的死亡細胞數(shù)量和壞死斑的大小[9]。由此可見，植物多肽在植物應(yīng)對病原菌的侵害過程中可以起到非常重要的作用，具有非常重要的應(yīng)用價值。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，多肽組學(xué)在近10年來也獲得了較多關(guān)注。然而，由于植物材料的特殊性，相較于動物，植物多肽組學(xué)的發(fā)展仍較為緩慢。在本研究中，筆者參考動物多肽組的純化過程[10-11]和植物蛋白質(zhì)組的提取方法[12-13]，對棉花根部的多肽提取方法進行探索和建立，利用高分辨級色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，對所提取的多肽進行NanoLC-MS/MS（納升級液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜）分析，利用已發(fā)表的棉花蛋白數(shù)據(jù)庫進行搜索比對，并手動驗證質(zhì)譜的分析結(jié)果。本研究將為系統(tǒng)研究棉花多肽組的生物學(xué)信息和挖掘具有重要應(yīng)用價值的新多肽提供新的方法和思路。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

供試棉花材料為亞洲棉中棉紅莖，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所張保龍研究員提供。

1.2?試驗時間和地點

本試驗于2018年3月至2019年4月進行，試驗在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所江蘇省重點實驗室及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院完成。

1.3?試驗方法

1.3.1?棉花根部多肽的分離提取?將亞洲棉中棉紅莖的種子用清水沖洗后，播種于盆缽中，待幼苗長至2葉1心時，采集植物的根部組織進行多肽提取。用液氮研磨葉片至粉末狀后，加入3倍體積的多肽提取液[含有7 mol/L尿素，2 mol/L硫代尿素，20 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇），5 μL Cocktail蛋白酶抑制劑]，振蕩提取15 min后，離心（4 ℃，12 000×g，10 min），取上清。上清液通過Microcon YM-10超濾管（Millipore，USA）除去分子量大于10 ku的大分子蛋白。在過濾后的上清中加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，于-20 ℃放置4 h。離心取沉淀（4 ℃，12 000×g，10 min），沉淀再用1倍體積的預(yù)冷丙酮洗1次，離心（4 ℃，12 000×g，5 min），棄上清，將沉淀倒置晾干。將沉淀加入70%乙腈[含0.1%TFA（三氟乙酸）]中，振蕩提取15 min，離心取上清（4 ℃，12 000×g，5 min）。用Millipore Ziptips（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）對上清液進行脫鹽處理，最終收集后抽真空干燥。將處理后的樣品用0.1%甲酸復(fù)溶，離心（4 ℃，12 000×g，2 min），取上清液進行Nano LC-MS/MS分析。

1.3.2?Nano LC-MS/MS分析分離鑒定?將多肽樣品于Nano-RSLC液相系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）中進行60 min的梯度洗脫，流速為300 nL/min，進樣量為 10 μL。采用納升電噴霧離子源，電離模式：電噴霧ESI（+），噴霧電壓為2.2 kV，毛細管溫度為200 ℃。一級質(zhì)譜在Orbitrap中掃描，掃描范圍是350～1 800 m/z，分辨率為 60 000。所得信息用PEAKS軟件進行De Novo（從頭）測序，并用測得的序列搜尋棉花蛋白數(shù)據(jù)庫，以得到最合適的鑒定結(jié)果。

2?結(jié)果與分析

2.1?棉花根部多肽的提取效果

植物內(nèi)源多肽的豐度通常都非常低，并且植物細胞外的細胞壁中及細胞內(nèi)含有大量色素，加上存在的次級代謝物等為多肽的獲得和分離帶來了極大困難。本研究由于后續(xù)應(yīng)用高分辨率的色質(zhì)聯(lián)用儀，因此在提取方法上排除了與色譜不相容的十二烷基硫酸鈉（SDS）法，筆者采用對分子量極小的蛋白分辨效果好的改良尿素法進行棉花多肽的提取。為了避免蛋白質(zhì)和多肽的降解，本試驗在樣品采集和提取過程中始終保持在低溫（4 ℃）下進行，并且在提取液中加入蛋白酶抑制劑。質(zhì)譜分析后用PEAKS studio軟件進行數(shù)據(jù)處理，將從頭測序、數(shù)據(jù)庫搜索2種方法結(jié)合進行多肽的鑒定。筆者從棉花根部組織共獲得809個小分子肽序列，詳見表1。這一結(jié)果表明，采用的改良尿素法對棉花多肽的分離效果較好。這些多肽的長度均較小，最大不超過70個氨基酸，以長度為10～20個氨基酸的多肽最多，其次為20～30個氨基酸長度的多肽。

2.2?棉花根部多肽的功能分類

由圖1可見，通過比對棉花蛋白數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)737個多肽可以匹配到已知蛋白上。通過對這些已知蛋白進行GO注釋，筆者發(fā)現(xiàn)這些多肽來源的基因在結(jié)合和催化活性、細胞過程、代謝過程功能亞類中所占的比例最高（圖1）。從未來生產(chǎn)應(yīng)用角度，本研究還發(fā)現(xiàn)了與抗病防衛(wèi)相關(guān)的蛋白包括病程相關(guān)蛋白10（PR10）、包含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的蛋白、過氧化氫酶、氧化還原酶等來源的多肽。例如，本研究發(fā)現(xiàn)病程相關(guān)蛋白10來源多肽的多個多肽，這些多肽除了序列較短，還伴有甲酰化、脫酰胺基化、乙基化等10種以上的氨基酸修飾方式，詳見圖2。

2.3?棉花根部多肽的定位

筆者將多肽的來源基因進行亞細胞定位預(yù)測。圖3的預(yù)測結(jié)果顯示，根部多肽來源的基因大多分布在細胞質(zhì)中（52%），其次分別分布在細胞核（23%）、質(zhì)體（20%）中，此外，還有少量多肽分布于細胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上、過氧化物酶上等。

3?討論與結(jié)論

在動物細胞及動物組織中，多肽和多肽組的提取方法較為成熟，然而在植物中，由于植物細胞結(jié)構(gòu)的特殊性，目前植物多肽組的提取仍然是多肽組學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟。在蛋白質(zhì)組的提取過程中，常使用的去垢劑如SDS、Trixton等可以快速高效地提取樣本的蛋白質(zhì)，然而由于這些去垢劑與色譜不相容，因此本研究采用了對分子量極小的蛋白分辨效果好的改良尿素法對棉花多肽進行提取。孫婷婷等利用尿素法，基于Nano LC-MS/MS在水稻葉片和根部共鑒別出約110個多肽，通過功能分析發(fā)現(xiàn)，這些多肽參與了水稻重要的生理活動[13]。在本研究中，筆者在提取液中加入了蛋白酶抑制劑，首先減少了內(nèi)源降解的干擾，其次使得提取過程保持在低溫環(huán)境下進行，另外，提取過程中的無機鹽提取劑在最后的除鹽步驟中被去除，極大地提高了植物多肽組的提取純度和效率。通過高分辨率的質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)整理，筆者發(fā)現(xiàn)這種方法的提取效果較好，在棉花根部組織中鑒定出809個多肽。

通過對這些多肽的前體蛋白功能進行功能注釋后發(fā)現(xiàn)，它們參與到細胞組成、 分子調(diào)控和生物代謝各個方面。例如筆者發(fā)現(xiàn)，病程相關(guān)蛋白來源的多肽可以調(diào)控植物的脅迫反應(yīng)。病程相關(guān)蛋白是植物在受到生物、非生物脅迫后產(chǎn)生的一種小分子蛋白，具有廣泛的功能，可以硬化細胞壁、傳導(dǎo)信號以及抗菌等[14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，病程相關(guān)蛋白10在參與植物的生長發(fā)育、次生代謝及應(yīng)對外界生物和非生物脅迫時發(fā)揮著重要的作用[15]。在對棉花的研究中發(fā)現(xiàn)，黃萎病病菌侵染可以誘導(dǎo)PR10蛋白的表達[16-17]。轉(zhuǎn)化煙草、擬南芥的試驗結(jié)果表明，PR10可以提高植株對黃萎病病菌的抗性，并且能提高植物抗菌素黃酮類化合物的水平。此外，PR10的表達也能改變煙草、擬南芥的表型，如轉(zhuǎn)基因植株生長延緩、轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片傾向于橫向生長而呈近圓形、頂端優(yōu)勢減弱、側(cè)生莖數(shù)量顯著增多等現(xiàn)象，證實PR10也參與調(diào)控植物的生長發(fā)育[18]。盡管PR10的部分重要功能已被鑒定，然而其調(diào)控機制到目前為止還不清晰。在本研究中，筆者通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，PR10可以產(chǎn)生多個不同修飾的多肽分子，因此推測PR10可能通過不同的多肽去調(diào)控不同的生長并應(yīng)對環(huán)境脅迫反應(yīng)。在后續(xù)研究中，筆者將聚焦這些重要多肽進行功能驗證。

植物天然多肽組的提取是植物多肽組學(xué)發(fā)展的一切基礎(chǔ)。通過探索高效的多肽分離方法，可以挖掘植物體中的天然活性多肽，后續(xù)將其作為生長調(diào)節(jié)劑或者抗菌藥劑人工合成應(yīng)用于生產(chǎn)，對于棉花增產(chǎn)抗病具有重要的理論與實踐意義。

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