超聲輔助提取多花黃精多糖工藝及生物活性研究

林志鑾 金曉懷 張傳海 李寶銀 華偉平

摘要：以多花黃精為材料，采用超聲波輔助法提取粗多糖，研究超聲波處理時間、料液比、超聲波功率對多糖含量的影響，并對多花黃精多糖的羥基自由基清除能力和牛血清熒光淬滅能力進(jìn)行評價。結(jié)果表明，最佳的提取工藝為料液比為1 ∶20（g ∶mL），超聲時間為20 min，超聲功率為810 W;在此條件下，測得杉木林多花黃精多糖含量為 108.57 mg/g。采用吖啶紅比色法測得毛竹林多花黃精多糖對羥基自由基的清除率為97.72%;利用牛血清蛋白熒光淬滅效應(yīng)測得天然闊葉林多花黃精的多糖對BSA蛋白淬滅能力為85.38%。

關(guān)鍵詞：多花黃精;林下套種;多糖;牛血清;自由基;提取工藝;生物活性

中圖分類號： R284.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0221-05

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）為百合科（Liliaceae）黃精屬多年生草本植物，是百合科黃精屬中質(zhì)量最佳、藥效最好的藥材之一。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，多花黃精具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、防動脈硬化、抗病毒、抗菌、提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用[1]。其中，多糖含量是多花黃精根莖的有效藥用成分，也是衡量其藥材質(zhì)量的主要指標(biāo)之一[2]。

目前，國內(nèi)學(xué)者對多花黃精進(jìn)行了組培方面的研究工作。如黃云鵬等對在毛竹林、闊葉樹林、杉木林、馬尾松4種林分類型下套種的多花黃精的根莖多糖含量及生長量進(jìn)行了分析[3];樊艷榮等研究了毛竹林下套種的多花黃精生長情況[4-5];鄭林森分析了杉木林上層密度對多花黃精根莖產(chǎn)量的影響[6]。這些主要是考察多花黃精的多糖類成分檢測。

用超聲波輔助提取多花黃精多糖與生物活性的研究還未見報(bào)道，本研究采用正交法對多花黃精超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并探討多糖提取物對羥基自由基的清除情況和牛血清的淬滅情況，為福建地區(qū)的多花黃精開發(fā)利用提供一定依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

原料：2017年10月于福建省邵武市朱山村（福建南武夷藥博園）中4種林（杉木林、天然闊葉林、毛竹林、人工闊葉林）林下采得多花黃精塊莖，經(jīng)武夷學(xué)院張傳海教授鑒定為多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），百合科，黃精屬。取其塊莖，洗凈，烘干，粉碎，過60目篩。

試劑：D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205，含量99.5%），牛血清蛋白（上海展云化工有限公司，批號：1408207，分子量：67000），硫酸、苯酚、三氯乙酸、吖啶紅、羅丹明B、十二烷基苯磺酸鈉、七水合硫酸亞鐵、30%過氧化氫、三氨基甲烷、濃鹽酸、氯化鈉、正丁醇，以上試劑為分析純。水為二次蒸餾水（自制）。

儀器：電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9070A（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），超聲波清洗機(jī)S10H（致微（廈門）儀器有限公司），熒光分光光度計(jì)F-4500（日立公司），高速藥物粉碎機(jī)WK-400A（山東省青州市精誠醫(yī)藥制造有限公司），循環(huán)真空泵SHB-Ⅱ（河南省鄭州長城科工貿(mào)有限公司），電子天平BS224SS（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?多花黃精多糖含量方法的建立

1.2.1.1?顯色反應(yīng)?準(zhǔn)確移取1.00 mL樣品溶液于具塞比色管中，加入1.00 mL 6%的苯酚，迅速加入5.00 mL 98%硫酸，靜置10 min，定容到25 mL，于80 ℃水浴中加熱30 min，即顯色完成[7]。用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長200～700 nm、發(fā)射波長 200～700 nm下進(jìn)行3D同步掃描，儀器工作條件：電壓為 700 V;激發(fā)狹縫為5 nm;發(fā)射狹縫為5 nm;掃描速度為 1 200 nm/min。并采用熒光分光光度計(jì)自帶軟件flsol.exe進(jìn)行3D數(shù)據(jù)處理。

1.2.1.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL的2.00 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于7支25 mL比色管中。參考“1.2.1.1”節(jié)步驟顯色完畢后，在激發(fā)波長λex=376 nm和發(fā)射波長λem=390 nm下測定其熒光值A(chǔ)。以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、熒光值為縱坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。

1.2.1.3?多花黃精多糖含量的測定

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末0.500 0 g，按照確定的優(yōu)化條件，進(jìn)行超聲提取;提取液經(jīng)過抽濾和減壓濃縮后，將濃縮液與三氯乙酸-正丁醇溶液 1 ∶1 混合，在-10 ℃下以12 000 r/min離心，除去蛋白，取下層清液10.00 mL于25 mL容量瓶中定容，按“1.2.1.1”節(jié)步驟顯色后，測定其熒光值A(chǔ)。然后根據(jù)“1.2.1.2”節(jié)的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，得到各樣品測試液的多糖濃度（mg/mL）;再按式（1）計(jì)算不同樣品的多糖含量。

式中：C為稀釋后樣品溶液多糖的濃度，mg/mL;N為稀釋倍數(shù);V為最初定容體積，mL;m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.1.4?單因素試驗(yàn)

以多花黃精提取液的多糖含量為指標(biāo)，分別對料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，g ∶mL），超時功率（60%、70%、80%、90%、100%），超聲時間（10、15、20、25、30 min）等有關(guān)因素進(jìn)行考察和分析，確定適宜的水平，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.1.5?正交試驗(yàn)

本研究在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察了料液比（g ∶mL）、超聲功率（W）、超聲時間（min）等3個影響因素，以確定最優(yōu)提取工藝條件。因素與水平見表1。

1.2.2?多糖提取的方法學(xué)考察

1.2.2.1?驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末5份，每份 0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即測熒光值，計(jì)算多花黃精多糖平均提取率和含量。

1.2.2.2?精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即連續(xù)6次測定溶液的測熒光值，計(jì)算其RSD值。

1.2.3.3?穩(wěn)定性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，顯色完成后立即測吸光度，之后每隔1 h測1次熒光值，考察6 h內(nèi)多糖的穩(wěn)定性。

1.2.2.4?加樣回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取多花黃精粉末5份，每份0.500 0 g，按照最佳提取工藝提取，得到多花黃精待測液。取該待測液0.50 mL于具塞試管中，再加入2.00 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.50 mL，顯色完成后測其熒光值。計(jì)算多花黃精糖平均加樣回收率。

1.2.3?羥基自由基的清除作用

1.2.3.1?激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定

參照吖啶紅光度法[8]進(jìn)行測定，取2支10 mL具塞比色管，在1支中加入 2.40×10-5 mol/L吖啶紅溶液、9.60×10-5 mol/L羅丹明B溶液、5.00×10-2 mol/L DBS溶液、0.80 mol/L H2SO4溶液、8.00×10-4 mol/L FeSO4溶液各0.50 mL，在另1支多加 0.50 mL H2O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%），定容到10 mL，反應(yīng)30 min后，測定其熒光強(qiáng)度，分別記為Aa、Ab，則自由基產(chǎn)生量可用ΔA=Aa-Ab表示。熒光工作參數(shù)測定與“1.2.1.1”節(jié)相同。

在該體系中，未加Fenton試劑及多糖體系的熒光值記為A1;未加多糖體系的熒光值記為A2;加入多糖提取液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或者維生素C對照液1.00 mL后，測定體系的熒光值為A3。按公式（2）計(jì)算多糖對羥基自由基的清除率：

1.2.4?牛血清蛋白熒光淬滅效應(yīng)的測定

參照李麗萍等的方法[9-10]進(jìn)行。吸取0.50 mL濃度為2×10-5 mol/L的牛血清蛋白（BSA）溶液，1.00 mL pH值7.40 Tris-HCl緩沖液（含0.30 mol/L NaCl），各自加入1.00～10.00 mL的葡萄糖試液、多花黃精多糖試液，用純水定容至25.00 mL，25 ℃ 恒溫靜置5 min后，測定其熒光強(qiáng)度，熒光工作參數(shù)的測定與“1.2.1.1”節(jié)相同。同時考察BSA蛋白淬滅方程關(guān)系，并計(jì)算牛血清蛋白的熒光淬滅率。按公式（3）計(jì)算多糖提取液對BSA蛋白淬滅率：

式中：A1′為加入多糖提取液熒光值，A2′為不加入多糖提取液熒光值。

2?結(jié)果與分析

2.1?熒光測定多糖含量的最大激發(fā)波長與發(fā)射波長確定

運(yùn)用熒光分光光度計(jì)分別對多糖、葡萄糖標(biāo)樣和空白試樣進(jìn)行3D掃描，以確定多花黃精多糖的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長，結(jié)果見圖1。確定本試驗(yàn)的檢測條件為激發(fā)波長λex=376 nm，發(fā)射波長λem=390 nm。

2.2?葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依照“1.2.1.2”節(jié)所描述的步驟方法測定葡萄糖的熒光值，得到回歸方程y=19 206x+49.636，r=0.996 6。線性范圍：0～64 μg/mL。

2.3?單因素試驗(yàn)

2.3.1?提取功率對多糖提取率的影響

固定料液比 1 g ∶20 mL、提取時間25 min，選擇一定提取功率（540、630、720、810、900 W）進(jìn)行多花黃精多糖提取，平行測定3次，其多糖含量如圖3-A所示。在超聲波功率為810 W時候，多花黃精多糖的含量達(dá)到6.28 mg/g，而后下降，因此最適宜的超聲波功率為810 W。

2.3.2?提取時間對多糖含量的影響

固定超聲功率 810 W、料液比1 g ∶20 mL，選擇一定提取時間（10、15、20、25、30 min）進(jìn)行多花黃精多糖提取，平行測定3次，其多糖含量如圖3-B所示。在超聲波時間為25 min時候，多花黃精多糖的含量達(dá)到7.72 mg/g，而后下降，因此最適宜的超聲波時間為 25 min。

2.3.3?料液比多糖含量的影響

固定超聲功率810 W、超聲時間25 min，選擇不同的料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，g ∶mL）進(jìn)行多花黃精多糖提取，平行測定3次，其多糖含量如圖3-C所示。在料液比為1 g ∶20 mL時候，多花黃精多糖的含量達(dá)到8.78 mg/g，而后下降，因此選擇料液比 1 g ∶20 mL 為佳。

2.4?正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)，進(jìn)一步考察超聲時間、料液比、超聲功率對多糖含量的影響，以確定最佳的提取工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，A、B、C 3種因素中，因素C極差值最大，因素A極差值最小，3種因素中對試驗(yàn)影響的主次順序依次是超聲時間>超聲功率>料液比。多糖最佳提取工藝組合是A2B2C1，即料液比為1 g ∶20 mL、超聲時間為 20 min、超聲功率為810 W，此時多花黃精的多糖提取率最高。

2.5?多花黃精多糖最佳提取工藝的方法學(xué)考察

驗(yàn)證試驗(yàn)：多花黃精多糖含量為93.06 mg/g（n=5）。

精密度試驗(yàn)：連續(xù)6次所測吸光度的RSD=1.97%（n=6），說明儀器精密度好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：多花黃精吸光度的RSD=1.74%（n=6），說明在6 h內(nèi)，多花黃精樣品溶液中的多糖采用本研究的顯色方法比較穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：多花黃精多糖的平均加樣回收率為 105.35%，RSD=1.33%（n=5）。

2.6?不同林分類型多花黃精多糖含量測定

按照“1.2.1.3”節(jié)試驗(yàn)步驟準(zhǔn)確稱取4種不同類型林分的多花黃精根莖粉末0.500 0 g，按照最佳提取工藝條件提取多花黃精多糖，并測定多糖的含量，結(jié)果見表3。

由表3可見，杉木林的多花黃精的多糖含量為 108.57 mg/g，明顯高于其他3組，而天然闊葉林、毛竹林、人工闊葉林3組之間差異不大。

2.7?多花黃精多糖對羥基自由基的清除能力

2.7.1?激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定

運(yùn)用熒光分光光度計(jì)分別對“1.2.3.1”節(jié)中的A1、A2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或者維生素C對照液進(jìn)行3D掃描，以確定清除·OH的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長，結(jié)果見圖4。確定本試驗(yàn)的檢測條件為激發(fā)波長λex=561 nm，發(fā)射波長λem=575 nm。其中，A1的熒光強(qiáng)度為2 450.00，A2的熒光強(qiáng)度為703.30。

2.7.2?多花黃精多糖對·OH的清除率

按上述“1.2.3.1”節(jié)試驗(yàn)步驟，測定多花黃精多糖提取液對·OH的清除作用，并代入公式（2）計(jì)算其清除率，結(jié)果見表4。試驗(yàn)表明，對羥基自由基的清除能力表現(xiàn)為毛竹林>人工闊葉林>杉木林>天然闊葉林，其中，毛竹林下套種的多花黃精的多糖對·OH的清除率最高，達(dá)到97.72%。

2.7.3?多糖提取液、葡萄糖標(biāo)液、維生素C對照液對·OH清除作用比較

測試體系中分別加入0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、3.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、多花黃精多糖提取液、維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行體外羥基自由基清除能力檢測，試驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著樣品加入量的增多，對于羥基自由基的清除率也在增大。當(dāng)多糖提取液加入量超過2.00 mL后，其羥基自由基清除能力超過97%。

2.8?牛血清蛋白的淬滅試驗(yàn)

2.8.1?激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定

通過熒光分光光度計(jì)分別對多糖、維生素C和空白試樣進(jìn)行3D掃描，確定多花黃精多糖與BSA相互作用的最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長，結(jié)果如圖6。根據(jù)3D預(yù)掃描的結(jié)果和多次試驗(yàn)，最終確定測試條件為λex=282 nm，λem=353 nm。

2.8.2?多糖含量與BSA蛋白淬滅作用

試驗(yàn)體系中分別加入1.00～10.00 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、多花黃精多糖提取液，考察各自與BSA的相互作用，結(jié)果見圖7。代入公式（3）計(jì)算其淬滅率，結(jié)果見表5。

由圖7可知，隨著葡萄糖和多花黃精多糖提取液加入量的增加，由于與BSA之間產(chǎn)生了結(jié)合反應(yīng)，體系中的熒光強(qiáng)度都呈規(guī)律性遞減，對BSA起到了一定的熒光淬滅作用。葡萄糖與BSA相互作用的指數(shù)方程是y=-454.6ln（x）+1 085.3（r=0.997 6）;多花黃精多糖提取液與BSA結(jié)合作用的指數(shù)方程為y=-1 278ln（x）+3 359.7（r=0.999 1）。

由表5可知，對4種林分類型淬滅率進(jìn)行對比，表現(xiàn)為天然闊葉 林> 毛竹林>杉木林>人工闊葉林，天然闊葉林的多花黃精的多糖對BSA蛋白淬滅能力最強(qiáng)，達(dá)到85.38%。

3?結(jié)論與討論

本研究以多花黃精為研究對象，探討并優(yōu)化超聲波輔助提取多花黃精多糖的提取工藝，對多花黃精多糖的羥基自由基清除率和牛血清蛋白淬滅率進(jìn)行評價。結(jié)果表明，在料液比為1 g ∶20 mL、超聲時間為20 min、超聲功率為810 W的條件下，測得杉木林、天然闊葉林、毛竹林、人工闊葉林下套種多花黃精多糖含量為108.57、97.48、98.99、93.06 mg/g;采用吖啶紅比色法在最佳波長λex=561 nm、λem=575 nm下，測得毛竹林、人工闊葉林、杉木林、天然闊葉林多花黃精多糖對羥基自由基的清除率為97.72%、92.23%、81.47%、76.15%;利用牛血清蛋白熒光淬滅效應(yīng)在最佳波長λex=282 nm、λem=353 nm下，測得天然闊葉林、毛竹林、杉木林、人工闊葉林多花黃精的多糖對BSA蛋白淬滅能力為85.38%、84.84%、83.79%、79.46%。

杉木林多花黃精多糖含量最高，為108.57 mg/g;毛竹林多花黃精的多糖對·OH的清除率最高，為97.72%;天然闊葉林多花黃精的多糖對BSA蛋白淬滅能力最強(qiáng)，為85.38%。造成多花黃精多糖含量、自由基清除率、BSA蛋白淬滅率差異的機(jī)制可能還與栽培方式、施肥狀況、種植年限等因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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