不同施肥處理對有機種植土壤微生物區系的影響

王超 劉明慶 黃思杰 李妍 田偉 陳秋會 王磊 席運官

摘要：在有機種植條件下，基于高通量測序分析復合微生物肥及有機肥的施用對有機冬瓜根區土壤微生物區系的影響，結合土壤化學性質及酶活性、有機冬瓜果實品質作相關分析。結果顯示，復合微生物肥的施用顯著降低土壤真菌群落豐富度，施用有機肥提高真菌群落豐富度，二者均提高土壤真菌、細菌種群多樣性;根區土壤中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門是優勢細菌，子囊菌門是優勢真菌;復合微生物肥和有機肥的施用均降低厚壁菌門和芽孢桿菌科的相對豐度，施用復合微生物肥提高結合菌門的相對豐度，降低毛殼菌科和肉座菌科的相對豐度，施用有機肥則相反。施肥顯著提高土壤過氧化氫酶、蔗糖酶活性;顯著提高冬瓜總氨基酸含量，顯著降低可溶性固形物含量。因此，施用復合微生物肥及有機肥可改變有機冬瓜根區土壤微生物的豐富度、多樣性及群落結構，提高土壤酶活性，改善有機冬瓜品質。

關鍵詞：復合微生物肥;有機肥;有機冬瓜;高通量測序;微生物區系

中圖分類號： S154.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0266-07

健康的土壤是農業種植生產的基礎，通過施肥培育健康土壤、提升土地質量是當前我國農業種植生產中提高作物產量和品質的關鍵環節。相較于常規農業中化學肥料的大量使用，施用復合微生物肥及有機肥是當前有機種植生產中改良土壤、增加土壤肥力的重要手段。與傳統有機肥料不同，復合微生物肥含有特定微生物[1]，田間施用會將大量微生物引入土壤局部區域，對有機種植土壤中原有的微生物區系造成影響，甚至會破壞土壤微生態平衡，須科學評價其對土壤微生態的影響。以往的研究主要探討了有機肥料施用對植物生產及土壤養分的影響，部分研究關注其對常規農業種植土壤微生物區系的影響[2-3]，而針對有機肥料影響有機種植土壤微生物區系的研究極少。對于土壤微生物的研究，傳統的分析方法包括瓊脂培養基培養法、Biolog平板法、磷脂脂肪酸法、PCR-變性梯度凝膠電泳（DGGE）和限制性內切酶片段長度多態性（RFLP）等，但均存在操作復雜、試驗周期長、痕量微生物檢測困難等弊端，無法深入分析，而高通量測序技術通過檢測土壤微生物細胞內特定遺傳物質（原核微生物16S rDNA/rRNA、真核微生物18S rDNA/rRNA）的堿基序列，可以更全面、準確地揭示土壤中微生物群落的復雜性和多樣性，已被廣泛應用于土壤微生物區系研究[4-6]。

2015年農業部制定了《到2020年化肥使用量零增長行動方案》，明確了“有機肥替代化肥”的技術路徑，同時確立“一控兩減三基本”的目標，力爭實現農藥化肥的零增長。在此背景下，有機肥料及微生物肥料的作用越來越凸顯。截至2016年7月，農業部登記的微生物肥料產品達到2 780個，年產量已突破1 000萬t，應用面積超過1 333萬hm2[7]。與之相對應的是我國有機作物種植面積的快速增長，截至2015年年底，有機植物生產面積為222.4萬hm2，有機生產面積已達全國農業耕地面積的0.77%[8]。隨著我國有機作物種植面積的不斷增長，有機肥及復合微生物肥必將被大量施用，然而其在提升有機種植耕作層土壤質量中的作用尚缺乏明確的科學依據，因此需要科學評測二者對有機種植土壤微生物區系的影響。本研究基于Illumina新一代Miseq平臺的高通量測序技術，結合相關生物信息學方法，全面分析土壤細菌16S rRNA基因V3+V4區和真菌ITS1區的多樣性指數及群落結構，旨在研究江蘇省儀征市有機蔬菜田在輪作種植條件下，復合微生物肥及有機肥對有機冬瓜根區土壤微生物多樣性和群落結構的影響，并結合土壤化學性質、酶活性以及有機冬瓜果實品質作相關分析，以期科學反映施用復合微生物肥及有機肥對有機種植土壤健康的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

田間試驗選址在江蘇省儀征江揚生態農業有限公司四莊基地有機蔬菜田（119°7′4.3″E，32°22′59.8″N;有機認證證書編號：134OP1200259），土壤類型為潮土，年平均氣溫 15.3 ℃，年日照時數2 054.1 h，無霜期224 d，年均降水量約994 mm。經本研究種植前采樣分析測定得到，試驗田0～20 cm 土壤基本性質：pH值6.59，銨態氮含量12.67 mg/kg，速效磷含量 20.33 mg/kg，速效鉀含量201.06 mg/kg，有機質含量33.27 g/kg，過氧化氫酶活性10.16 U/g，蔗糖酶活性 15.67 U/g，脫氫酶活性271.91 U/g，脲酶活性1 330.98 U/g，酸性磷酸酶活性17.42 U/g。

1.2 試驗設計

試驗于2017年5—10月進行，采用隨機區組設計，共設置3個處理，分別為復合微生物肥處理（B）、有機肥處理（O）和對照（C），每個處理設置3個重復，共9個小區，每個小區面積為3 m×10 m=30 m2，保護行寬為1 m，走道寬及小區間排水溝寬均為0.5 m。試驗作物為冬瓜[Benincasa hispida （Thunb.） Cogn.]，前茬作物為青菜（Brassica chinensis L.）。復合微生物肥處理和有機肥處理施肥作為基肥，施用量均為1 500 kg/hm2，對照組不施肥。田間管理及有害生物防治采取有機管理模式。

復合微生物肥[微生物肥（2017）準字（2285）號]由作物秸稈制作而成，總養分含量為8%，有機質含量為20%，有效活菌數為0.2億個/g，其中細菌數量為0.16億個/g，真菌數量為0.03億個/g，其他菌種數量為0.01億個/g。有機肥[蘇農肥（2012）準字0381號]的有機質含量≥45%，總養分含量≥5%。

1.3 樣品采集

土壤樣品采集于第1次盛花期進行，用土壤采樣器鉆取各處理小區0～20 cm根區土壤，按照“S”形多點取樣，每小區鉆取6鉆，去除根系、雜草、土壤動物和石塊等雜質后充分混勻作為1個根區土壤樣品，采用四分法平均分成2份，低溫保存帶回實驗室，分別置于-80 ℃和-20 ℃冰箱保存備用。

有機冬瓜樣品統一采集第2批進入成熟期的冬瓜果實，每個處理隨機選取3個果實進行品質測定。

1.4 土壤性質測定

土壤樣品經自然風干、研磨過篩（1 mm）后，參照文獻[9]的方法測定其理化性質。其中，pH值使用pH計測定（土水比1 g ∶5 mL）;將土壤樣品用濃度為 0.5 mol/L 的K2SO4溶液浸提1 h后，用連續流動分析儀測定氨態氮含量;速效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-分光光度法測定;速效鉀含量采用1 mol/L CH3COONH4浸提-火焰光度法測定;有機質含量采用油浴外加熱-K2Cr2O2容量法測定。土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、脫氫酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性分別使用南京建成生物工程研究所提供的土壤酶試劑盒測定。

1.5 土壤微生物總DNA提取和高通量測序

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（OMEGA，美國）的試劑盒提取土壤微生物總DNA，采用NanoDrop-ND1000測定提取的DNA濃度，并經2%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進行檢測，合格后用于構建文庫;以各土壤樣品微生物總DNA為模板，以細菌V3+V4區（338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[10]和真菌ITS1區（ITS1F 5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;2043R 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）[11]特異性引物為擴增引物進行融合引物PCR;采用Illumina MiSeq測序平臺對PCR擴增產物進行雙端測序分析，測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.6 有機冬瓜品質測定

游離氨基酸含量測定參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》;可溶性固形物含量測定參照GB/T 8210—2011《柑桔鮮果檢驗方法》;可溶性總糖含量測定參照NY/T 1278—2007《蔬菜及其制品中可溶性糖的測定 銅還原碘量法》;總酸度測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》;糖酸比以可溶性總糖含量與總酸度的比值表示;蛋白質含量測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》;粗纖維含量測定參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》;維生素C含量測定參照GB 5009.86—2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》;硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.7 數據處理與分析

土壤理化性質、土壤酶活性及有機冬瓜品質數據采用Microsoft Excel 2010軟件進行整理和圖表制作，用DPS 7.05進行方差分析（LSD法），顯著性水平設定為0.05。

測序數據采用FLASH[12]和Trimmomatic[13]軟件進行過濾優化和雙端序列連接，優質序列利用Usearch軟件基于97%的相似水平進行OTU（operational taxonomic units）聚類，根據Silva細菌數據庫[14]和Unite真菌數據庫利用RDP Classifier進行物種注釋和分類[15];基于OTU豐度信息，利用R語言工具制作稀釋曲線（rarefaction curve）、Venn圖和群落柱形圖，利用Mothur軟件計算α-多樣性指數（Shannon、Simpson、Chao、ACE）[16-17]，并用Excel和DPS進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物文庫測序結果評價

本研究對9個土壤樣品進行了Illumina MiSeq高通量測序，數據經過濾優化，細菌文庫共得到392 525條有效序列，序列長度分布在267～516 bp之間，97%相似水平下聚類獲得21 528個OTU;真菌文庫共得到541 244條有效序列，序列長度分布在204～452 bp之間，97%相似水平下聚類獲得 5 694 個OTU。每個樣品的有效序列數量和OTU數量如表1所示，各處理組間細菌文庫的有效序列數和OTU數、真菌文庫的有效序列數差異不顯著，處理組B真菌文庫的OTU數顯著低于處理組O和對照組C（P<0.05）。

稀釋曲線反映了樣品文庫測序數據量的合理性，可用于評價測序數據量能否覆蓋所有類群。細菌和真菌多樣性稀釋曲線（圖1）顯示，隨著測序量的不斷增大，各樣品OTU數目的增加趨勢趨于平緩，最終基本達到飽和，說明測序數據量合理;在97%相似水平上計算各土壤樣品測序的覆蓋率，結果（表2）顯示，細菌文庫測序覆蓋率在98%以上，真菌文庫測序覆蓋率在99%以上，說明取樣合理，處理組間微生物文庫測序覆蓋率差異不顯著。因此，測序數據能夠真實地反映土壤樣品中的微生物群落，但可能仍有少量微生物種類未被發現。

2.2 施肥對根區土壤微生物群落豐富度和多樣性的影響

Shannon指數和Simpson指數用于反映土壤樣品中微生物的多樣性，前者數值越大，表示群落多樣性越高;后者數值越大，表示群落多樣性越低[18]。表2數據顯示，施用肥料后，處理組B有機冬瓜根區土壤細菌Shannon指數、Simpson指數下降，處理組O Shannon指數上升、Simpson指數下降，但與對照組C之間差異均不顯著。處理組B土壤真菌Shannon指數上升、Simpson指數下降，處理組O Shannon指數、Simpson指數上升，與對照組C之間差異均不顯著。可見，有機冬瓜根區土壤施用復合微生物肥和有機肥可分別在一定程度上提高土壤真菌、細菌種群多樣性。

ACE指數和Chao指數可反映群落物種豐富度。由表2數據可知，有機冬瓜根區土壤細菌ACE指數和Chao指數在施用復合微生物肥后上升，上升幅度分別為3.17%和3.98%，處理組O指數變化幅度不大，均與對照組C之間差異均不顯著。與對照組C相比，施用復合微生物肥顯著降低土壤真菌的ACE指數、Chao指數（P<0.05），分別降低8.39%、9.39%;處理組O指數小幅上升，差異不顯著。結果表明，施用復合微生物肥在一定程度上豐富了有機冬瓜根區土壤細菌群落結構，但顯著降低真菌群落豐富度;施用有機肥則提高了土壤真菌群落豐富度。

2.3 施肥后根區土壤微生物類群分析

在97%的相似水平上，對照組C、處理組B、處理組O土壤樣品分別得到2 373、2 422、2 380個細菌OTU（平均值），差異不顯著;得到631、595、672個真菌OTU（平均值），處理組O顯著高于對照組C和處理組B（表1）。可見，施用復合微生物肥和有機肥在一定程度上提高了有機冬瓜根區土壤細菌類群的特異性;施用復合微生物肥顯著降低土壤真菌類群的特異性，施用有機肥則顯著提高土壤真菌類群的特異性。

Venn圖可直觀展現并反映組間或樣品之間的OTU數目組成相似性、重疊情況以及特異性[19]。由圖2-A可知，對照組C、處理組B和處理組O之間共有的細菌OTU數目為 2 257個，代表的物種分別屬于α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、放線菌綱（Actinobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、酸桿菌綱（Acidobacteria）和芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）（占比超過1.5%的綱）。對照組C、處理組B、處理組O特有的OTU數分別為59、74、67個，說明施用復合微生物肥和有機肥會增加有機冬瓜根區土壤特有細菌物種。

從圖2-B中可以看出，對照組C、處理組B和處理組O共有的真菌OTU數目為474個，主要共有物種分別屬于盤菌綱（Pezizomycetes）和糞殼菌綱（Sordariomycetes）（占比超過7%的綱）。對照組C、處理組B、處理組O特有的OTU數分別為74、74、127個，說明施用有機肥會增加根區土壤特有真菌物種。

2.4 施肥對根區土壤微生物群落分布特征的影響

在門分類水平上的細菌類群分布及相對豐度如圖3-A所示，有機冬瓜根區土壤樣品中的細菌包含變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）等菌群，處理組B、處理組O和對照組C細菌群落組成相似;除了未分類的其他菌群，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門的相對豐度較高，屬于優勢細菌;施用復合微生物肥和有機肥不同程度地降低了根區土壤厚壁菌門的相對豐度，分別比對照組C降低18.55%、26.07%;處理組B根區土壤酸桿菌門相對豐度較對照組C降低25.09%，而處理組O則升高32.38%。從細菌科的分類水平（圖3-B）上看，除未確定科類外，有機冬瓜根區土壤中芽孢桿菌科（Bacillaceae）、黃色單胞菌科（Xanthomonadaceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）和鞘酯菌科（Sphingomonadaceae）的相對豐度均較高（數值>3%），屬于優勢細菌;施用復合微生物肥和有機肥分別使芽孢桿菌科相對豐度降低了18.09%、26.37%。

圖3-C為有機冬瓜根區土壤真菌在門分類水平上的物種柱狀圖，子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）等在處理組B、處理組O和對照組C土壤樣品中均有分布，子囊菌門是優勢菌群，相對豐度占比超過84%;受限于數據庫的原因，相對豐度排名第2的菌群未能分類;施用復合微生物肥使根區土壤接合菌門的相對豐度提高35.99%，施用有機肥則降低接合菌門的相對豐度，降幅為22.29%。圖 3-D顯示，有機冬瓜根區土壤真菌在科水平上主要包括毛殼菌科（Chaetomiaceae）、肉座菌科（Hypocreaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、發菌科（Trichocomaceae）和小囊菌科（Microascaceae）等，除了未確定科類的菌群外，子囊菌門中毛殼菌科的相對豐度在處理組B、處理組O和對照組C中均最大，是優勢菌群;施用復合微生物肥降低了毛殼菌科、肉座菌科的相對豐度（比對照組C降低19.37%、46.02%），施用有機肥則提高了毛殼菌科、肉座菌科的相對豐度（比對照組C提高23.07%、42.00%）;施用復合微生物肥、有機肥均降低了叢赤殼科的相對豐度（比對照組C降低39.36%、22.95%）。

2.5 施肥對根區土壤化學性質及酶活性的影響

本研究于有機冬瓜第1次盛花期測定了根區土壤化學性質及酶活性，結果（表3）顯示，處理組B、處理組O和對照組C土壤銨態氮、速效鉀、速效磷含量均低于種植前，處理組B各項化學性質指標略低于對照組C，處理組O則高于對照組C（除pH值外），差異均不顯著。施用有機肥和復合微生物肥顯著提高了根區土壤過氧化氫酶及蔗糖酶活性，對脫氫酶、脲酶和酸性磷酸酶活性影響不顯著（表4）。

2.6 施肥對有機冬瓜品質的影響

本研究對第2批進入成熟期的有機冬瓜果實進行了營養品質指標測定分析，結果（表5）顯示，施用復合微生物肥和有機肥均顯著提高有機冬瓜果實總氨基酸、總糖、總酸的含量（處理組B比對照組C分別上升15.38%、135.29%、14.29%;處理組O比對照組C分別上升7.69%、17.65%、14.29%），二者均顯著降低了可溶性固形物、蛋白質、維生素C的含量（處理組B比對照組C分別下降13.31%、26.86%、34.27%;處理組O比對照組C分別下降17.34%、45.14%、14.77%）;施用有機肥可提高有機冬瓜果實硝酸鹽含量，較對照組C升高5.64%，影響不顯著;施用復合微生物肥可顯著降低有機冬瓜果實硝酸鹽含量（P<0.05），較對照組C降低 12.09%。

3 討論

當前，高通量測序技術已被廣泛用于土壤微生物的群落結構及多樣性研究[5]。針對復合微生物肥及有機肥施用對有機種植土壤微生物區系影響的研究鮮有報道，本研究基于Illumina Miseq平臺，對有機冬瓜根區土壤細菌16S rRNA基因V3+V4區域和真菌ITS1區域進行高通量測序，結合相關生物信息學方法分析發現，施用復合微生物肥會提高細菌群落多樣性，降低土壤真菌群落豐度，與顧欣等在設施田塊西瓜種植中應用菌肥的研究結果[20]一致。基于Silva和Unite數據庫分析顯示，有機冬瓜根區土壤中變形菌門、厚壁菌門和放線菌門是主要細菌類群，與Schloss等利用16S rRNA對農田土壤細菌進行生態學分類的結果[21]一致;子囊菌門是主要真菌類群，與Roesch等對土壤微生物群落的研究結果[22]一致。

α-多樣性指數是有效評價土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的指標[23]。本研究發現，施用有機肥提高了有機冬瓜根區土壤細菌多樣性Shannon指數，施用復合微生物肥提高了細菌豐富度ACE、Chao指數，游偲等同樣發現，采用枯草芽孢桿菌菌劑處理后的煙草根際土壤細菌多樣性指數和豐富度指數均提高[24]。多數植物病原菌來自真菌，康捷等發現，麻山藥糊頭病和根莖腐病發病植株土壤真菌多樣性和豐富度均高于健康植株[25]，本研究顯示，施用復合微生物肥能顯著降低有機冬瓜根區土壤真菌群落豐富度，表明它在一定程度上能減少有機種植作物受病原真菌侵害的概率。有機肥可為土壤微生物的活動提供所需的碳源、氮源和能量，并可改善土壤微生態環境的理化性狀，促進微生物的生長和繁殖，增加微生物數量[26];有機質被認為是影響土壤微生物動態的主要因素[27];本研究同樣發現，施用有機肥會提高土壤細菌和真菌群落多樣性及豐富度，土壤有機質含量也相應提高。

本研究發現，施用復合微生物肥和有機肥均會降低有機冬瓜根區土壤真菌叢赤殼科的相對豐度，同時，有機肥處理組土壤毛殼菌科真菌相對豐度升高。李發虎等發現，施用玉米秸稈生物炭后黃瓜結果期土壤子囊菌門毛殼菌科比例明顯提高[28]。毛殼菌通過重寄生和產生毛殼素等抗生素對病原菌產生拮抗作用，是重要的植物病害生防真菌[29]。子囊菌門叢赤殼科（Nectricaceae）菌多屬菌生真菌，可以寄生病原真菌[30]。可見，施用復合微生物肥有助于控制有機種植作物病害發生。

有機肥有機質含量高、養分全面、肥效長，在作物種植中發揮著改良土壤、改善土壤微生物群落結構、提高作物品質等作用[31]。本研究發現，復合微生物肥及有機肥的施用均能顯著提高土壤過氧化氫酶和蔗糖酶活性;與對照組相比，有機肥處理在一定程度上提高了有機冬瓜果實硝酸鹽含量，與汪峰等對大棚黃瓜施用有機肥的研究結果[32]一致;李瑞霞等研究表明，木霉NJAU4742生物有機肥處理的番茄果實硝酸鹽含量降低[33]，本研究同樣發現，施用復合微生物肥能顯著降低有機冬瓜果實硝酸鹽含量，可能與其中特定的微生物有關;同時，有機肥處理在一定程度上提高了土壤銨態氮、速效鉀、速效磷和有機質等養分含量。曲成闖等同樣發現，施用復合微生物肥能提高黃瓜不同生育期潮土土壤過氧化氫酶、脲酶活性[34]。研究表明，土壤微生物量關系到土壤肥力狀況是否良好，它們之間存在顯著相關性[35]。同樣，土壤酶活性與土壤微生物關系密切，影響土壤微生物的因素同樣影響土壤酶活性[31]。珊丹等發現，施用微生物菌肥的土壤中可培養細菌、真菌菌落數量均顯著高于未施肥處理（P<0.05），而且細菌、真菌菌落數量與土壤蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶活性之間有一定的正相關性[36]。本研究中土壤微生物群落結構變化與過氧化氫酶、蔗糖酶活性顯著變化的相關性還需進一步探討。

土壤微生物類群復雜，微生物群落特征是多種微生物種群協同作用的結果，不能依照單一或某幾個種群的變化闡釋施肥對有機種植土壤微生物區系的影響，后續研究將進行長期定位連續觀測，并對微生物群落特征與土壤化學性質及酶活性等相關指標進行相關性分析，進一步揭示其影響作用。本研究還發現，根區土壤微生物中未分類或未確定種屬的物種受復合微生物肥和有機肥施用的影響，受限于數據庫原因，未能解釋，有待通過深度測序或利用其他先進手段對這些微生物進行更細致深入的分類研究。

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